Columnas bioZen™. Serie biológica de Phenomenex
BioTi™: Trayectoria del flujobiocompatible
Relájese al saber que hemos minimizado la necesidad del cebado con una nueva estructura y frita biocompatibles cubiertas de titanio ¡que no interfieren con la integridad de las proteínas ni péptidos!
- Análisis de heterogeneidad de carga de anticuerpos monoclonales
- Mapeo de péptidos
- Análisis de agregados
- Análisis de glicanos
- Cuantificación de péptidos
- Relación anticuerpo-fármaco
- Masa intacta
- Análisis de proteínas intactas y de fragmentos
Aumente la duración de la columna con los sistemas de cartuchos protectores
Los nuevos sistemas de cartuchos SecurityGuard™ Standard y ULTRA eliminan los contaminantes indeseados antes de que obstruyan su columna o sistema. Cada columna bioZen™ tiene su precolumna para asegurar la estabilidad en el trabajo diario.
Las proteínas nos dijeron qué tienen en MENTE y nosotros escuchamos. La estructura BioTi™ de titanio de bioZen™ para HPLC/UHPLC está diseñada para limitar las interacciones secundarias indeseadas, sustancias de acarreo problemáticas y dificultades de recuperación entre la inyección y la detección.
Inyecciones superpuestas ‑ Comparación del cebado de proteínas
Tres plataformas de partículas innovadoras
Las tres nuevas plataformas de partículas bioZen™ fueron diseñadas y creadas individualmente por Phenomenex para obtener la máxima ventaja de los niveles fundamentales de rendimiento, robustez y reproducibilidad para aplicaciones de caracterización de proteínas. La diferencia en cada plataforma radica en las técnicas de procesamiento patentadas que se utilizan para controlar el tamaño y morfología de las partículas. Con toda la MENTE puesta en los detalles de las partículas, ¡imagínese cómo se ven nuestros laboratorios!
Totalmente porosa modificada térmicamente
Mediante una serie de procesos térmicos patentados, eliminamos los microporos, obtenemos así una columna más inerte y además mejoramos la consistencia, la eficiencia, la robustez y la reproducibilidad de la columna.
Tecnología core-shell
Usando la técnica sol-gel que incorpora la tecnología de nano estructuración, se forma una cubierta porosa, homogénea y duradera, que envuelve el núcleo sólido de sílica. Este proceso sumamente optimizado, en combinación con la tecnología de empaque líder en la industria, produce columnas altamente reproducibles que elevan la eficiencia y sensibilidad.
Partícula polimérica no porosa de tamaño uniforme
La tecnología de partículas de tamaño uniforme controlada meticulosamente asegura una excelente homogeneidad de partículas que ofrece una eficiencia superior y reproducible. Esta innovadora partícula no porosa funciona como la columna vertebral perfecta para el intercambio de iones en mezclas químicas complejas.
Ocho composiciones químicas de las partículas
Con una sola línea de productos innovadores que abarca las principales áreas de trabajo biológicas, ahora puede descansar y dejar de revisar múltiples catálogos, marcapáginas y proveedores. Dele un respiro a su MENTE con las composiciones químicas de partículas de alta calidad diseñadas y probadas para productos biológicos.
La proteína se encuentra con la ciencia de la separación
Tenemos en MENTE que lo mejor para los productos biológicos es que los bioquímicos y expertos en cromatografía unan fuerzas. En verdad, nuestro talento está a su disposición con exhaustiva experiencia en todas las áreas referente a la composición química, conjugación, preparación de muestras, análisis y detección de proteínas.
Mapeo de péptidos
Los AcMo (anticuerpos monoclonales, o mAb) digeridos o conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) incluyen una amplia gama de compuestos que son cruciales para comprender las modificaciones posteriores. Así que diseñamos las dos columnas bioZen™ Peptide para ofrecer perfiles de retención muy útiles y únicos. Cada columna ofrece ventanas de elución más rápidas al utilizar partículas core-shell de alta eficiencia o totalmente porosas modificadas térmicamente para obtener picos más definidos, con mayor capacidad y sensibilidad general.
Análisis de agregados
Con la frecuente presencia de agregados de AcMo (mAb) a niveles muy bajos (0.1% por área comparado con el monómero) y la separación de fragmentos como requerimiento, una resolución y forma de pico adecuadas se convirtieron en objetivos de métodos aún más cruciales. Para abordar esta necesidad, la robusta línea de columnas bioZen™ de exclusión por tamaño fue desarrollada con una combinación de la eficiencia y alta sensibilidad del UHPLC para obtener resolución e identificación de los niveles más bajos de analitos.
Análisis de agregados
La consistencia de partículas altamente inertes en ambas columnas bioZen™ SEC producen mayor reproducibilidad de una inyección a otra. Combine esto con la estructura bioinerte BioTi™, y ya no se perderá una buena recuperación de agregados.
Análisis de heterogeneidad de carga de anticuerpos monoclonales
BioZen WCX fue diseñada para descifrar de manera consistente entre las variantes de proteínas nativas que surgen de las modificaciones postraduccionales (PTMs) en la creación y desarrollo de terapéuticos. Las partículas poliméricas no porosas de tamaño uniforme contienen cadenas lineales de policarboxilato que envuelven y separan las proteínas de las variantes ácidas y básicas. Con un proceso de fabricación altamente optimizado y controlado, el relleno de bioZen WCX le permite a los científicos caracterizar la heterogeneidad de carga de anticuerpos monoclonales de manera reproducible. Esto es en adición a la excelente recuperación proporcionada por las partículas altamente inertes y la estructura bioinerte de las columnas de titanio BioTi.
Mientras que las partículas poliméricas no porosas de tamaño uniforme sirven como el vehículo perfecto para las cadenas de policarboxilato, estas partículas robustas también aseguran que la bioZen™ WCX sea resistente a los complejos sistemas de gradiente de concentración de sal y de pH. Esta robustez y alta estabilidad, en combinación con una selectividad consistente, permiten que los científicos no se conformen con optar por gradientes de pH o de concentración de sal cuando necesiten separar y cuantificar variantes de carga de proteínas, compuestos innovadores y biosimilares. A veces, es bueno saber que tiene opciones.
Análisis de glicanos
La exclusiva selectividad de la bioZen Glycan fue diseñada para proporcionar mejores separaciones de los glicanos liberados y etiquetados. Con una partícula core-shell de 2.6µm, los usuarios que tengan sistemas HPLC o UHPLC pueden usar la columna bioZen Glycan para obtener resultados de alta eficiencia a mayores velocidades lineales y formas de picos más definidas en tiempos de corridas más rápidos, sin la alta presión de UHPLC. Bajo condiciones HILIC-FLR o HILIC-MS, la bioZen Glycan se destaca por su mayor retención polar y selectividad.
bioZen N-Glycan Clean-Up:
¡Una novedosa fase estacionaria HILIC para extracción en fase sólida (SPE) que se destaca en la retención y recuperación de glicanos etiquetados y liberados! Disponible en formato de placa de microelución de 96 pocillos que funciona de manera excelente en el procesamiento y limpieza de pequeños volúmenes de muestra.
Cuantificación de péptidos
Al cuantificar péptidos distintivos de las matrices biológicas, usted necesita formas de picos definidas y una retención suficiente de los péptidos hidrofílicos para evitar cualquier pérdida de señal de las áreas de supresión de la matriz. Las dos columnas bioZen™ Peptide fueron desarrolladas para dar excelente selectividad incluso entre los péptidos más similares.
Además, desarrollan el CUERPO de características valiosas con maneras únicas de obtener formas de picos más definidas de los péptidos básicos; la bioZen Peptide XB-C18 bloquea las interacciones superficiales secundarias mediante la cadena lateral de isobutilo, mientras que la bioZen Peptide PS-C18 contiene una base débil con carga positiva que repele otras especies básicas.
Análisis de proteínas intactas y fragmentos
La identificación y caracterización de impurezas de fragmentos biológicos intactos es todo un desafío por las mínimas diferencias entre las variantes. Las dos columnas bioZen Intact poseen partículas core-shell fabricadas especialmente con poros grandes para que puedan ofrecer picos más altos y delgados con mayor resolución entre las HC/LC, Fc/Fab o sus isoformas.
Masa intacta
La masa intacta puede dar indicaciones no solo de la abundancia relativa de glicoformas, sino también de la estabilidad, ya que los AcMo degradados no darán una buena carga mediante ESI-MS. La masa intacta con un espectrómetro de masas de alta resolución para identificar PTM, en especial la abundancia relativa de glicoformas, funciona perfectamente con los rápidos tiempos de análisis y las formas de picos delgados que proporcionan las columnas bioZen™ Intact C4 y XB-C8.
Flujo de trabajo simplificado para la caracterización de productos biológicos en el sistema X500B QTOF
Acelere su rendimiento con este sistema QTOF para mesa de trabajo fácil de usar que combina una instrumentación robusta con un software poderoso e intuitivo para obtener sus resultados de caracterización de manera más rápida y sencilla.
Relación anticuerpo‑fármaco (DAR)
Con un efecto directo en la eficacia y la seguridad, debe comprenderse bien la conjugación de cada ADC. La bioZen Intact XB-C8 ofrece un vehículo excelente para determinar la distribución de la carga de fármaco y la relación anticuerpo-fármaco (DAR, que proviene del inglés Drug Antibody Ratio) para los ADC. Su poro de gran tamaño permite que los ADC intactos interactúen con una fase estacionaria moderadamente retentiva mientras que las partículas core-shell brindan mayor eficiencia para brindar la resolución necesaria entre las especies de ADC con diferentes cargas de fármacos.
Bio controles de calidad
En cada etapa de nuestros controles de producción y calidad tenemos a usted y a sus análisis de productos biológicos en mente. En primera instancia nos concentramos en productos innovadores que mejorarán los flujos de trabajo, luego trabajamos incansablemente para asegurarnos de que esos productos sean confiables una y otra vez. Para enriquecer aún más la calidad de estos productos, asignamos protocolos de control orientados a aplicaciones muy específicas que imitan las condiciones que usted y otros usuarios requieren.
Cada lote de medios y cada columna pasa por una serie de controles para asegurarnos de que usted está recibiendo nuestra ciencia en su mayor nivel, y así podrá entrar al progreso sin escalas.
El flujo bioZen™. Selección de la columna
Queríamos copiar su dedicación por los análisis biológicos, por lo que pusimos nuestra ALMA y corazón en el desarrollo de la gama de productos bioZen. En todo el desarrollo de un elemento biológico, los productos de separación bioZen ofrecen una mejor caracterización en una amplia variedad de técnicas.
bioZen N-Glycan Clean-Up
¡Una novedosa fase estacionaria HILIC para extracción en fase sólida (SPE) que se destaca en la retención y recuperación de glicanos etiquetados y liberados! Disponible en formato de placa de microelución de 96 pocillos que funciona de manera excelente en el procesamiento y limpieza de pequeños volúmenes de muestra.
Consejos de nuestros maestros zen en separación de proteínas. Exclusión por tamaño y un buffer saturado con sal
Al desarrollar un método para el análisis de agregados de AcMo por SEC, resulta crítico optimizar las condiciones de la fase móvil para evitar interacciones secundarias no específicas. A continuación, puede ver el efecto al alterar la concentración de sal en la fase móvil para dos diferentes biosimilares de AcMo. El primer AcMo necesitó una cantidad moderada de sal para lograr una forma de pico aceptable. El segundo AcMo se desempeñó bien incluso sin sal. Sin embargo, al aumentar la sal se vieron mejoras en la forma de los picos.
De manera ideal, el buffer y la concentración de sal se optimizan según los requerimientos del método o análisis. No obstante, cuando hay necesidad de un método plataforma, como cuando se deben evaluar diferentes AcMo, un buen punto de partida para el desarrollo del método es 50mM de fosfato potásico, 250mM de cloruro de potasio, pH 6.8.
Sobre la desglicosilación. ¿Cómo debo desglicosilar mi anticuerpo?
PNGase F es una endoglicosidasa que se adhiere a los N-glicanos sin preferencia, a excepción de los que están fucosilados a(1-3); me atrevo a asegurar que si está trabajando con insectos y plantas, felicitaciones, está haciendo un trabajo interesante en el mundo de la glicobiología.
La mayoría de los protocolos para PNGase F se desarrollaron originalmente para desglicosilar glicoproteínas complejas, es decir, proteínas con múltiples sitios de glicosilación. Por ejemplo, la fetuina bovina, un modelo común de glicoproteína, posee 18 sitios de glicosilación.[1] Por lo tanto, la mayoría de los protocolos se desarrollan usando una desglicosilación durante la noche para asegurar que la desglicosilación se complete.
¿Qué hacer si necesita tener respuestas mañana? Para una glicoproteína menos compleja como una IgG1 (2 puntos de glicosilación en la región conservada en Asn297), es aceptable un tiempo de digestión más corto. De hecho, la mayoría de los proveedores venden PNGase F formulada para una desglicosilación más rápida, en algunos casos de diez minutos o menos. Además, como los puntos de glicosilación son de fácil acceso, no se requiere la desnaturalización.[2]
¿Por qué debo de desglicosilar mi ADC o anticuerpo antes de usar masa intacta?
Dependiendo de cuántas glicoformas diferentes pueda tener la muestra, un grado alto de complejidad en la glicosilación puede llevar a espectros bastante desordenados, algo especialmente difícil con ADC.
Por lo tanto, la desglicosilación debe poder ofrecer espectros más aceptables, para lograr así una evaluación mejor de la cantidad relativa de las diferentes especies de DAR, como también el DAR promedio.
Algo importante a considerar: la desglicosilación del N-glicano producen ácido aspártico (Asp), lo que genera un cambio de masa a 1 Da. Y algo más: el buffer para reacciones con PNGase F es, típicamente, Tris, es decir, con un pH relativamente alto. Se podría observar desamidación, comúnmente con el motivo NG, por lo que podrían desearse protocolos de desglicosilación más rápidos.
Consejos de nuestros maestros zen en separación de proteínas. Capacidad de carga para SEC y fase reversa
¿Cómo determino la capacidad de carga de una columna SEC?
Para la exclusión por tamaño, existen dos consideraciones: volumen de muestra y concentración de la muestra.
Por regla general, no cargue más del 5% del volumen de la columna. En teoría, una columna de 300×4.6mm, con un volumen de ~5ml, tendría un volumen de inyección límite de 200µl. En la práctica, son comunes los volúmenes de 10-30µl.
Otra consideración importante es la concentración de la muestra; cuanto mayor sea la concentración de proteína, mayor será la viscosidad de la muestra, y esta diferencia en viscosidad puede provocar distorsión en la forma de los picos (ya sea por los efectos de la exclusión o por el empuje del solvente menos viscoso sobre un fluido más viscoso).
Un buen punto de partida es 1mg/ml, aunque las concentraciones óptimas deben determinarse de manera experimental.
¿Cuál es la capacidad de carga de las columnas bioZen™ Intact y Peptide?
Para las columnas bioZen Peptide, se pueden usar cargas similares a otras columnas RP-LC: 5-20µg de mezcla peptídica o de digestión en una columna de 4.6mm DI dará una buena sensibilidad (especialmente para LC-MS) para separación de péptidos. Se puede cargar hasta 50µg de una muestra de digestión sin aumentar demasiado el ancho de los picos. Para columnas de 2.1mm DI se debe escalar la carga de manera acorde.
En el caso de las columnas bioZen Intact, debido a su área superficial menor, la carga puede tener consecuencias drásticas sobre la forma de los picos y debe determinarse de manera experimental para obtener resultados óptimos. Para 4.6mm DI, 5µg es un buen punto de partida. Para 2.1mm DI, 1µg es un buen punto de partida. Al aumentar la carga puede aumentar el tailing y el ancho del pico de manera significativa.
Solvente orgánico y exclusión por tamaño
Para obtener una separación SEC “ideal” (es decir, una separación puramente entrópica, sin interacción del analito con la fase estacionaria), a menudo podría necesitarse un modificador orgánico, 5-15% isopropanol o acetonitrilo.
Sin embargo, la pregunta ahora es si la proteína se encuentra en un estado verdaderamente nativo; uno de los contribuyentes principales de la agregación son las interacciones hidrofóbicas entre monómeros y fragmentos.
La mayoría de los métodos para ADC usan solventes orgánicos, de los cuales el 15% IPA es el más común. Esto está ampliamente aceptado para evaluar los agregados, aunque puede ser necesario confirmar los resultados con una ultracentrifugación analítica de la velocidad de la sedimentación ortogonal (SV-AUC).
¿Cómo se debe limpiar una columna si habitualmente se usa para analizar muestras de proteínas?
Si se sospechan interacciones iónicas fuertes entre las proteínas y la fase estacionaria, comience limpiándola con un desnaturalizante como hidrocloruro de guanidinio 6 M o 10% DSMz. Si la proteína es relativamente hidrofóbica, comience enjuagándola con un tampón con 95-100% agua, luego limpie las proteínas hidrofóbicas con una gradiente desde 95% agua 5% acetonitrilo hasta 5% agua 95% acetonitrilo por los 3-5 volúmenes de la columna. Durante cada paso, tenga cuidado de que las presiones no excedan los límites recomendados; ajuste los niveles de flujo según sea necesario.
Protección biocompatible
La manera más fácil de aumentar el rendimiento de una columna y minimizar el deterioro costoso del sistema y el detector es evitando que en la columna entren contaminantes y partículas y pasen a su LC con un sistema de protección. Los sistemas de cartuchos protectores SecurityGuard brindan esta protección verdaderamente facilitan la incorporación de este beneficio para los sistemas HPLC y UHPLC.
Limpieza selectiva para volúmenes de muestra pequeños
Con su formato de placa de microelución, tanto el sorbente polimérico Strata-X para SPE como bioZen N-Glycan Clean-Up ofrecen dos grandes beneficios: mejor recuperación absoluta y mayor ahorro de tiempo.
bioZen. N-Glycan Clean-Up por SPE
Una fase estacionaria HILIC que se caracteriza por una óptima retención y recuperación de N-glicanos etiquetados y liberados.
Strata X. Sorbente polimérico Strata-X para SPE
Desalinice su muestra antes de inyectarla en su columna para obtener resultados más precisos y mayor vida útil de la columna.
[1] Nwosu, Charles C., et al. “Simultaneous and Extensive Site-Specific N- and O-Glycosylation Analysis in Protein Mixtures.” Journal of Proteome Research, vol. 10, no. 5, June 2011, pp. 2612–2624., doi:10.1021/pr2001429
[2] Hosfield, C., Engel, L., Paguio, A., Surowy, T., Jones, R., Ford, M., Urh, M., Rosenblatt, M. Recombinant PNGase F for Glycoprotein Analysis. Página web de Promega Corporation. http://www.promega.com/resources/pubhub/recombinant-pngase-f-for-glycoprotein-analysis-article/ Actualizado en 2013. Citado el 29 de enero, 2018.
