Autores: Scott A. Borden1,2, Armin Saatchi1,
Chris G. Gill1,2, Neloni R. Wijeratne3

1 Laboratorios de investigación ambiental aplicada Universidad de la isla de Vancouver, Nanaimo, BC
2 Universidad de Victoria, Victoria, BC
3 Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA

Desarrollar un procedimiento de análisis de orina basado en MS cuantitativa fiable de drogas de abuso y sus metabolitos para la investigación clínica o de toxicología forense capaz de cumplir con los valores de corte establecidos utilizando Thermo Scientific ™ Espectrómetro de masas TSQ Fortis ™ con la fuente de iones Thermo Scientific ™ VeriSpray ™ PaperSpray.

Introducción
Los laboratorios forenses y clínicos cuantifican habitualmente las drogas de abuso en matrices biológicas, siendo la orina una de las más comunes debido a la facilidad de obtención. La mayoría de las veces, los fármacos se cuantifican mediante métodos cromatográficos que requieren mucho tiempo y requieren una preparación significativa de la muestra. Por lo tanto, un método alternativo que proporcione resultados comparables de alto rendimiento es de gran valor para los laboratorios forenses y clínicos. PS-MS es una alternativa viable a la cromatografía para el análisis rápido de drogas de abuso en orina, demostrando suficiente sensibilidad, precisión y exactitud para ser de relevancia clínica y forense.

La espectrometría de masas por pulverización de papel (PSMS) se describió por primera vez en 2010 como un método para el análisis directo de muestras complejas sin preparación de muestras. PS-MS utiliza pequeños volúmenes de muestreo (<10 μL) depositados directamente en una tira de papel. Directamente frente a la entrada del espectrómetro de masas, se aplica solvente al papel para extraer analitos y se aplica alto voltaje para ionizarlos. Se recopila un cronograma de la corriente de iones durante un período breve (generalmente <1 min) y se integra para cuantificar el analito. La ionización por pulverización de papel junto con la espectrometría de masas de triple cuadrupolo permite realizar mediciones cuantitativas rápidas y sensibles (ng / ml bajos) en una variedad de muestras complejas, como sangre y orina. El sistema VeriSpray PaperSpray incluye un cargador de placas VeriSpray y un cargador que admite hasta 10 cartuchos VeriSpray, cada uno con 24 tiras de papel. Este sistema totalmente automatizado permite un análisis de alto rendimiento sin arrastre de muestras. La Figura 1 muestra el sistema VeriSpray montado en el TSQ Fortis MS, así como el cargador extraíble y los cartuchos VeriSpray.

En este estudio, la fuente de iones VeriSpray PaperSpray acoplada a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo TSQ Fortis se evaluó como una herramienta para la cuantificación de drogas de abuso y sus metabolitos en muestras de orina humana para aplicaciones en investigación clínica y toxicología forense.

Se cuantificó un conjunto de 41 fármacos y metabolitos diferentes elegidos para representar las principales clases de fármacos (p. Ej., Opiáceos y opioides, anfetaminas, fentanilo y sus análogos y benzodiazepinas) en muestras de orina humana agrupadas, y la validación del método se llevó a cabo mediante un control de calidad emparejado por matriz. muestras.

Experimental. Preparación de la muestra
Se utilizó una selección de 41 fármacos y metabolitos de varias clases de fármacos (incluidos opioides, anfetaminas, benzodiazepinas y sustancias psicoactivas novedosas) para crear patrones de curva de calibración en muestras de orina humana en blanco agrupadas de cinco fuentes. Se prepararon curvas de calibración de nueve puntos (n = 6 repeticiones) en consecuencia para cumplir con los valores de corte establecidos y abarcar el rango de concentraciones esperadas en las muestras de orina. Se prepararon soluciones de trabajo de fármacos y patrones internos marcados isotópicamente en metanol y se añadieron a la matriz de orina combinada. Para el análisis, se colocaron alícuotas de 8 μl de orina enriquecida en cartuchos VeriSpray y se dejaron secar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Condiciones de PaperSpray y MS
El espectrómetro de masas de triple cuadrupolo TSQ Fortis se utilizó para todos los análisis y se acopló con el sistema VeriSpray PaperSpray para la ionización. Los disolventes de PaperSpray utilizados (disolventes de rehumedecimiento de la muestra y de pulverización) fueron acetonitrilo / agua 90/10 con ácido acético al 0,1% y se aplicaron según los ajustes de la Tabla 1. Los parámetros de espectrometría de masas se optimizaron utilizando un voltaje de pulverización de +3,8 kV, un tiempo de ciclo 1,2 segundos y resolución Q1 y Q3 a 0,7
Da FWHM.
Los parámetros de la fuente se describen en la Tabla 2. Los ajustes óptimos del lente de RF y las energías de colisión para los iones del producto se determinaron por infusión directa de estándares en el espectrómetro de masas utilizando la fuente de ionización por electropulverización calentada. Las transiciones de SRM optimizadas para todos los analitos objetivo y estándares internos se enumeran en la Tabla 3. La distancia entre la punta del papel y la entrada de MS se estableció en 5,0 mm.

Validación del método
La validación del método se realizó de acuerdo con las prácticas estándar del Grupo de Trabajo Científico de Toxicología Forense (SWGTOX) para la validación de métodos en toxicología forense. Se prepararon muestras de control de calidad bajo, medio y alto de manera que la muestra de control de calidad bajo estuviera cerca del valor de corte, la muestra de control de calidad alto estuviera al 80% del calibrador más alto y el control de calidad medio estuviera en el punto medio de las muestras de control de calidad alto y bajo. Las muestras de control de calidad se analizaron diariamente (n = 5 réplicas), durante un período de cinco días para determinar los valores de precisión (% CV) y precisión (% de sesgo) dentro y entre ejecución:

Adquisición y análisis de datos
Se utilizó el software Thermo Scientific ™ TraceFinder ™ versión 4.1 SP5 optimizado para la investigación clínica para la adquisición y el procesamiento de datos automatizados.
Todas las regresiones lineales utilizaron una ponderación de 1 / ×. Los límites inferiores de cuantificación (LLOQ) se determinaron a partir del estándar de calibración más bajo que cumplía con los siguientes criterios: R2 ≥ 0,98,% CV ≤ 15 y % de sesgo ≤ ± 20, y un valor S / N> 4. El ruido se definió como el promedio de 10 mediciones repetidas de orina humana reunida.

Resultados y discusión
Se lograron calibraciones con buena linealidad (R2> 0,98) para los 41 fármacos y metabolitos y se utilizaron para la cuantificación de muestras de control de calidad preparadas en orina en blanco combinada. Los modelos de calibración, los LLOQ y los valores de corte se describen en la Tabla 4. La validación del método se llevó a cabo de acuerdo con las pautas de SWGTOX; Los resultados aceptables se indican cuando los valores de precisión (% CV) no superan el 20% y los valores de precisión (% Bias) no superan ± 20%. Los resultados típicos de los compuestos representativos de las principales clases de fármacos se describen en la Tabla 5. Los valores de LLOQ determinados están por debajo o cerca de los valores de corte establecidos para la toxicología forense o clínica. El tiempo total de análisis de las manchas de orina secas, incluida la extracción (aprox. 1,1 min) seguido del análisis espectrométrico de masas (1,2 min), fue de aproximadamente 2,3 minutos.

Conclusión
El sistema VeriSpray se aplicó con éxito para la cuantificación precisa y precisa de diversas drogas de abuso y sus metabolitos en muestras de orina humana para su uso en investigación clínica o toxicología forense. Un tiempo total de análisis de ~ 2 minutos junto con la eliminación del requisito de pretratamiento / preparación de muestras y separación permite que todos los laboratorios de investigación clínica y / o toxicología forense aborden más muestras con mayor confianza y, a su vez, aborden sus objetivos comerciales y científicos..

Referencias
1. Liu, J .; Wang, H .; Manicke, N.E .; Lin, J-M .; Cooks, R.G .; Ouyang, Z. Desarrollo, caracterización y aplicación de ionización por pulverización de papel. Química analítica. 2010, 82 (6), 2463–71.
2. SWGTOX. Prácticas estándar del Grupo de Trabajo Científico de Toxicología Forense (SWGTOX) para la validación de métodos en toxicología forense. Revista de Toxicología Analítica. 2013, 37, 452–74.

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