Detección y Cuantificación de residuos de pesticidas en aceite de oliva utilizando un Orbitrap Exploris 240 HRMS
Palabras clave: Explorador de plaguicidas, QuEChERS, espectrómetro de masas Orbitrap Exploris 240, analizador Orbitrap, cuantificación, cribado desconocido, masa exacta de alta resolución (HRAM), aceite de oliva, TraceFinder
Objetivo
Desarrollar y probar un método instrumental de múltiples residuos, que se pueda aplicar para la cuantificación y screening de residuos de pesticidas desconocidos, en matrices alimentarias, por debajo de los requisitos legislativos actuales. Se operó con un espectrómetro de masas de alta resolución y masa exacta (HRAM) en modo de adquisición independiente de datos de escaneo completo (DIA) y utilizando un flujo de trabajo de exclusión de fondo AcquireX™ Thermo Scientific™, que ofrece una opción para filtrado de espectro completo, análisis retrospectivo e identificación de compuestos basada en parámetros múltiples. El método se probó en más de 400 pesticidas, en modo positivo y negativo, con una opción para una futura extensión a una mayor cantidad de analitos.
Introducción
La demanda de un análisis rápido y sencillo de un gran número de muestras en aplicaciones agrícolas crece cada año. En todo el mundo, los pesticidas se usan para controlar plagas que son dañinas para los cultivos, los seres humanos y los animales.
Estas sustancias pueden representar una amenaza significativa para la salud y, por lo tanto, deben detectarse con precisión en los niveles requeridos por las autoridades gubernamentales. Por lo general, los niveles máximos de residuos de pesticidas en diferentes productos de origen vegetal y animal se establecen en niveles bajos de parte por billón (ppb). Las regulaciones actuales presentan desafíos analíticos significativos con respecto a los bajos límites de cuantificación y la gran cantidad de analitos de interés.
La mayoría de los métodos rutinarios basados en LC suelen emplear espectrometría de masas de triple cuadrupolo. En los últimos años, la disponibilidad de los analizadores de masas Orbitrap™ Thermo Scientific™, proporciona una mayor confianza en la identificación y confirmación de compuestos junto con capacidades cuantitativas comparables a las de MS/MS de triple cuadrupolo. La precisión de la masa (normalmente por debajo de 5 ppm) minimiza las interferencias de los analitos c-eluyentes y los co-extractos de matriz y, por lo tanto, reduce la posibilidad de falsos resultados positivos o negativos. Este trabajo describe los parámetros del método utilizando el último modelo de instrumento de sobre-mesa LC-Orbitrap, el espectrómetro de masas Thermo Scientific™ Orbitrap Exploris™ 240 y su uso para examinar cientos de analitos objetivo, en o por debajo de los niveles legislativos (niveles máximos de residuos – LMR) en matriz de aceite de oliva.
Preparación de la muestra
El aceite de oliva se compró en un mercado local y se analizó para determinar los niveles de base de pesticidas. Se pesaron aproximadamente 5 g de aceite de oliva en un tubo cónico de 50 mL. Luego, se agregaron al tubo 10 mL de acetonitrilo, 6 mL de agua y 100 μL de estándar interno. Esta mezcla se tapó y se agitó vigorosamente durante 5 minutos. Se agregó un paquete de Thermo Scientific™ QuEChERS™ (4000 mg MgSO4, 1000 mg NaCl, 500 mg citrato Na2 y 1000 mg citrato Na3), que incluye todas las sales necesarias para el proceso de extracción. La mezcla se agitó durante aproximadamente 1 minuto y luego se centrifugó a >3300 rpm durante 15 minutos. Se aspiró una alícuota de 2 ml del sobrenadante y se filtró a través de un filtro de 0,45 μm en un vial. El sobrenadante recuperado se pasó a través de un cartucho de eliminación de lípidos a un vial de HPLC y se enriqueció con los niveles de calibración necesarios. Se realizó una inyección de 1 μl con el sistema UHPLC binario Thermo Scientific™ Vanquish™ Flex equipado con una columna de fase reversa aQ Accucore™ Thermo Scientific™.
Experimental
Reactivos, todos Fisher Scientific
- Acetonitrilo, grado uHPLC-MS (N/P A956-1)
- Formiato de amonio >99% (N/P A115-50)
- Metanol, grado uHPLC-MS (N/P A458-1)
- Ácido fórmico, extrapuro para HPLC (N/P 28905)
Preparación estándar de calibración
Se preparó un estándar MegaMix tomando 10 μL de cada vial (~1000 μg/mL) y agregándolos a todos en un solo contenedor. Para la calibración, se preparó un conjunto de calibración de 5 niveles añadiendo después el extracto de aceite de oliva de control con la mezcla en concentraciones que oscilaban entre 0,5 y 500 (0,5, 1,0, 5, 10, 500) ppb. Todos los niveles de calibración se inyectaron seis veces.
- Agua, grado uHPLC-MS (N/P W8-1)
Consumibles
- Vial de HPLC Thermo Scientific™(N/P A4954-010)
- Tapones roscados y septos de 10 mm de boca ancha Nacional™Thermo Scientific™(N/P C4010-60A)
- columna aQ, Thermo Scientific™™Accucore™100 × 2,1 mm,
- 2,6 micras (N/P 17326-102130)
Estándares
Los pesticidas se compraron a Ultra Scientific. Consulte las tablas de resultados para conocer la identidad de todos los plaguicidas investigados para un análisis específico.
Parámetros de HPLC
Tabla 1. Programa de ejecución en gradiente de HPLC
Adquisición y procesamiento de datos
Los datos se adquirieron y procesaron con el software TraceFinder™ Thermo Scientific™ para garantizar la automatización completa desde la configuración del instrumento hasta la adquisición, procesamiento y generación de reportes. Los datos adquiridos en modo DIA, se analizaron con una tolerancia de masa de ≤5 ppm para iones precursores y productos. Los analitos se cuantificaron en función de los datos de escaneo completo. Además, la confirmación de los pesticidas target se realizó mediante la comparación de fragmentos DIA con una biblioteca espectral de alta resolución. Se aplicó el flujo de trabajo de exclusión de fondo Thermo Scientific™ AcquireX™ y los datos se extrajeron con una tolerancia de masa ≤5 ppm para iones precursores y productos. Los pesticidas conocidos se confirmaron utilizando una librería específica de pesticidas, y sus respectivas similitudes espectrales. Todos los pesticidas desconocidos se pasaron automáticamente al flujo de trabajo de productos desconocidos, en el software TraceFinder, para ser buscados en bases de datos de compuestos en línea, así como otras bases de datos locales.
Resultados y discusión
Se llevó a cabo una validación interna simplificada para los métodos semicuantitativos y de detección en pesticidas específicos. La linealidad de las curvas de calibración se evaluó en el rango de 0,5 a 500 ng/mL para demostrar el potencial del método para el análisis cuantitativo. La selectividad del método se evaluó mediante la comparación de muestras de aceite de oliva en blanco y enriquecidas (n=6). La evaluación se basó en un precursor preciso m/z valor del analito en la ventana de tiempo de retención especificada (±0,1 min). La cuantificación de escaneo completo basada en la coincidencia monoisotópica, la presencia de iones de fragmentos (FI) y la búsqueda de biblioteca espectral de pesticidas (LS) de alta resolución, se aplicó adicionalmente para la confirmación de acuerdo con las Referencias 1 y 2. Los valores de aceptación se establecieron en menos de, o igual a, 5 ppm para precisión de masa (FS y MS2), ± 0,1 min para el tiempo de retención, reproducibilidad en LOQ ≤15 %, al menos un ion de fragmento presente y para pasar LS que coincida con un informe mayor o igual al 60 % y a r2 ≥ 0,9000. Los valores establecidos se muestran en la Tabla 2.
Energía de colisión HCD
La metodología mostró una excelente reproducibilidad en términos de a) formas de pico consistentes y vida de columna robusta, con más de 250 inyecciones y b) respuesta de pico consistente a lo largo del tiempo. La Figura 1 muestra pesticidas seleccionados en el rango de tiempo de retención del método (0 a 8 minutos), para 250 inyecciones con un cambio de retención de menos de 0,1 min. La Figura 2 muestra un cromatograma de un estándar emparejado con matriz (MMS) de 10 ppb para un método que contiene más de 500 pesticidas con cambio de polaridad positiva y negativa durante todo el proceso. Se obtuvieron suficientes puntos de datos en cada pico para una cuantificación precisa.
Figura 1. Reproducibilidad robusta de LC-MS de pesticidas añadidos en aceite de oliva, pesticidas seleccionados (superposición de inyecciones de 1 a 250) con tolerancia de masa extraída de 3 ppm
Figura 2. Cromatograma de más de 500 pesticidas en 15 min en aceite de oliva MMS enriquecido a 10 ppb. El pico resaltado a los 4,32 min es la hexazinona que muestra más de 11 escaneos en el ion de cuantificación de escaneo completo utilizado para el análisis.
La implementación del flujo de trabajo de exclusión de fondo AcquireX también ayuda en la identificación de contaminantes desconocidos utilizando una rutina única para crear automáticamente una lista de exclusión basada en el análisis LC-MS de la matriz en blanco. El método del instrumento se actualiza automáticamente con la lista de exclusión, de modo que cuando se analizan las muestras posteriores, los experimentos de MS2 no se realizan en las señales de fondo de la matriz. Como resultado, se dedica más tiempo de ciclo a la activación de MS2 en los iones relevantes de interés. Esto es innovador para el procesamiento de datos porque es minimizar los falsos positivos y negativos. Utilizando el software TraceFinder, estos nuevos archivos de datos adquiridos se pueden usar rápidamente y realizar el procesamiento de datos para flujos de trabajo de detección conocidos y desconocidos. El software TraceFinder puede pasar fácilmente de un flujo de trabajo conocido a uno desconocido simplemente seleccionando una casilla de verificación (Figura 3). El software se puede configurar para buscar múltiples bibliotecas espectrales, junto con bases de datos espectrales en línea como ChemSpider, simplemente seleccionando la opción de función de búsqueda exhaustiva (Figura 4).
Figura 3. Fácil configuración del software TraceFinder a partir de un flujo de trabajo de detección conocido para activar inmediatamente un flujo de trabajo de detección desconocido con una marca
Figura 4. Los parámetros de búsqueda desconocidos se activan fácilmente marcando la casilla. La capacidad de buscar múltiples bibliotecas espectrales seleccionadas de mzCloud localizadas le brinda la confianza de la coincidencia exacta.
Esta función garantiza que se muestren los mejores resultados según los criterios de búsqueda seleccionados. La Figura 5 muestra la sección de revisión de datos rápida y fácil del flujo de trabajo de evaluación específica con cuadrículas clasificables e información detallada en la parte inferior. El clorpirifos (resaltado) se muestra como un ejemplo de precisión de medición de masa consistente del espectrómetro de masas Orbitrap Exploris 240. Solo aquellos compuestos que no se identificaron en el flujo de trabajo de detección dirigido se moverán automáticamente al flujo de trabajo desconocido para una mayor investigación.
En la Figura 6 se muestra un ejemplo de esto para los compuestos que se trasladaron al flujo de trabajo de selección desconocido. En muchos casos, se utilizó la base de datos ChemSpider para identificar y etiquetar los aciertos más probables con la composición elemental correspondiente. Se identificaron muchas incógnitas como sustancias químicas del aceite graso (ácido oleico) del aceite de oliva (p. ej., ácido palmitoleico y ácido miristoleico). También se identificó un compuesto único llamado erucamida, y la investigación muestra que es un “aditivo deslizante” que se usa más comúnmente en plásticos y luego se usó como lubricantes (Figura 7).
Figura 5. Descripción general rápida de la detección de compuestos específicos para clorpirifos con una puntuación de biblioteca del 89 % y ∆ppm de 0,1837
Figura 6. Descripción general rápida de la detección de desconocidos donde se enumera rápidamente la identificación. Aquí hay un ejemplo destacado del ácido palmitoleico que se encuentra en la muestra, un ácido graso en el aceite de oliva que no estaba siendo abordado.
Figura 7. Resumen rápido de un examen desconocido que encontró enucamida, un lubricante en el aceite de oliva
La figura 8 muestra las curvas de calibración para ametrina y fenazaquin de 0,5 a 100 y de 0,5 a 500 ppb, respectivamente. Más del 95% de los pesticidas estudiados tenían curvas de calibración con r2> 0,950 (Tabla 2). Los iones de fragmentos de confirmación se muestran en el medio de cada panel a 1 y 0,5 ppb para cada pesticida, con colores indicadores (verde) fácilmente visibles para mostrar el paso de iones de fragmentos y criterios seleccionados de la biblioteca espectral Thermo Scientific™mzCloud™. Se desarrolló y optimizó un método de cambio depolaridad de más de 500 pesticidas para garantizar que se detectara al menos un ion de fragmento por compuesto. Los LOQs se determinaron como se indica en las directrices SANTE/11813/2017, con los resultados que se muestran en la Figura 9.
Figura 8. Iones de cuantificación y iones de confirmación en MMS en aceite de oliva, junto con el rango de calibración de 0,5 a 100 (500) ppb en el software TraceFinder para ametrina a 1 ppb y fenazquin a 0,5 ppb, que muestra una excelente coincidencia de iones de fragmentos r2, MS2. La técnica permite una cuantificación y una detección seguras con una confirmación muy por debajo la concentración LMR.
Figura 9. LOQs de plaguicidas en MMS en aceite de oliva obtenidos siguiendo las directrices SANTE para el método de cribado de más de 400 plaguicidas
Conclusión
Se ha demostrado que, para grandes listados de plaguicidas, el análisis cuantitativo a niveles iguales o inferiores a los LMR de la UE, proporcionan una excelente sensibilidad y robustez en un entorno de laboratorio de rutina para la matriz de aceite de oliva. Además, el software TraceFinder le brinda la flexibilidad de detectar contaminantes desconocidos en la muestra. La capacidad de buscar en bases de datos en línea, permite la identificación de incógnitas debido a la excelente precisión de masa y el alto poder de resolución del espectrómetro de masas Orbitrap Exploris 240, lo que reduce significativamente el número de posibilidades de identificación extrañas. El nuevo flujo de trabajo de exclusión de fondo AcquireX, que utiliza la actualización automática de un método de instrumento con una lista de exclusión creada a partir de una inyección de matriz en blanco, permite la eliminación de iones de fondo no deseados en MS2 para muestras reales, haciendo más fiable la identificación. Actualmente existe un trabajo en curso para evaluar el rendimiento de los residuos en extractos de matrices extraídas que contenian un spike de estándar (MES).
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a ISVEA y al equipo local de Thermo Fisher Scientific por el apoyo en el desarrollo del método.
Referencias
- Procedimientos de validación de métodos y control de calidad para el análisis de residuos de plaguicidas en alimentos y piensos.Bibliotecas de referencia de la UE para residuos de http://www.eurl-pesticidas. eu/docs/public/tmplt_article.asp?CntID=727
- Criterios de aceptación para la confirmación de identidad de residuos químicos utilizando datos de masa exacta para el programa FVM de la FDA.Oficina de Alimentos y Medicina Veterinaria de la Administración de Drogas y Alimentos de EE.UU.
Tabla 2. Nombre del compuesto, r2, concentración LOQ, RT, ∆ppm, %RSD, FI y puntuación de la biblioteca
Autores: Francesca Barbetti, Carlos Yang, Débora D’Addonna3, Christian Klass
ISVEA SrL, Siena, Italia
Thermo Fisher Scientific, San José, CA
Thermo Fisher Scientific, Radano, Italia Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania
Más información:
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