a
Somos una Editorial con más de 20 años de trayectoria en la elaboración de productos impresos y digitales dedicados a los Laboratorios Analíticos.

Últimas Novedades

HPLC: Guía de resolución de problemas

Introducción

 Esta guía de resolución de problemas contiene ejemplos de algunos de los problemas más comunes encontrados en cromatografía de fase reversa y como solucionarlos. Se cubren cuatro áreas principales

  • Forma de los picos,
  • Cambios en el tiempo de retención
  • Picos fantasma
  • Problemas relacionados con la contrapresión de la columna

Además se incluye una guía de cuidado de columnas

 

1.   Forma de pico

1.1. La cola de los picos o Tailing ha sido el problema más común de la forma de los picos desde los primeros días de la cromatografía en fase reversa. La mayor parte de la cola de los picos se debe a la interacción con grupos de silanol ácidos o ionizados en la superficie de las partículas de sílice dentro de la columna. La sílice de baja pureza (a menudo llamada “Tipo-A” o sílice ácida) tiene un alto contenido de grupos silanol ácidos (-Si-OH) y la presencia de impurezas metálicas (especialmente hierro y aluminio) aumenta aún más la ionización de estos grupos a -Si-O-, que proporciona sitios de intercambio de cationes. El pKa de estos materiales se encuentra en la región de pH 4-5, lo que significa que a pH>6 la mayoría de los grupos silanol están ionizados. Los esfuerzos por mejorar la pureza y reducir la acidez de la sílice condujeron a la obtención de partículas de sílice de mayor pureza (“Tipo B”) y, desde su introducción inicial, la pureza de estos paquetes de sílice ha mejorado. La sílice de alta pureza tiene un pKa de >8, por lo que la ionización del silanol es mínima en el rango de pH estable de 2<pH<8 para la mayoría de las columnas.

Los compuestos básicos son los más susceptibles al silanol tailing y, dado que una alta proporción de las moléculas de la muestra contienen grupos funcionales nitrogenados básicos, pocos compuestos son completamente inmunes a las interacciones del silanol. La cola de silanol se ilustra en la Figura 1. El tolueno, un compuesto neutro, no está sujeto a la cola de silanol, pero los restantes analitos de la Figura 1 son fármacos fuertemente básicos. Un pH de la fase móvil de 6, que ioniza los silanoles de las columnas de sílice de menor pureza, dificulta aún más la separación. La sílice de menor pureza (Fig. 1a), representativa de la sílice de tipo A, tiene interacciones tan fuertes con las bases que los analitos no se eluyen de la columna. Los primeros materiales de tipo B (Fig. 1b) mejoraron significativamente la forma de los picos, de modo que todos los picos de la muestra son visibles, aunque tengan una mala cola. Las mejoras posteriores en la pureza de la sílice (Fig. 1c) han reducido los picos a niveles aceptables. Es poco probable que se elimine la cola de los picos mientras se utilice sílice que contenga silanol en la RP-HPLC.

El tailing de silanol se reduce mejor utilizando una columna de sílice de alta pureza, pero hay otras técnicas para reducir el tailing. Durante muchos años, la  trietilamina (TEA), se añadió a la fase móvil (por ejemplo, a 25 mM) para este fin. La TEA es un competidor muy eficaz para los grupos silanol ácidos, pero con la sílice de alta pureza actual, la TEA no es necesaria y se utiliza   raramente.

 

Posibles soluciones:

a) Utilizar columna con relleno de sílice de alta pureza

b) Agregar 25 nM de Trietilamina(TEA) en la fase móvil

 

1.2. Buffer o aditivo de fase móvil insuficientes también pueden dar lugar a tailing en los picos. La función principal de un tampón es mantener la muestra en un estado de ionización constante, para estabilizar la retención y minimizar la cola de los picos debido a las interacciones iónicas. El tampón también suprime la ionización de los grupos de silanol en la superficie de la sílice. Esto, por supuesto, es un reto mayor para los materiales de sílice menos puros, donde los silanoles ionizados son mucho más probables. El efecto de la concentración del aditivo en la forma de los picos se ilustra en la figura 2. En este  caso, el ácido trifluoroacético (TFA) actúa como un reactivo de emparejamiento de iones para los componentes de la muestra de proteínas y también crea una fase móvil de bajo pH para suprimir la ionización del silanol. Tradicionalmente, el TFA al 0,1% se ha utilizado como aditivo para las separaciones de proteínas y péptidos. Como puede verse en la Figura 2a y b, esta concentración es suficiente para minimizar la formación de colas tanto en columnas de sílice de alta y moderada pureza. Sin embargo, cuando la concentración de TFA se reduce diez veces (Fig. 2c, d), la cola aumenta con   ambas fases. La sílice de alta pureza sigue manteniendo una forma de pico aceptable, pero la cola del pico en la columna de pureza moderada es ahora inaceptable.

 

Posibles soluciones:

a) Agregar entre 10-25 mM de TFA a la fase móvil

 

 

1.3. Distorsión de todos los picos del cromatograma suele ser el resultado de un problema físico, más que químico. Cuando todos los picos del cromatograma muestran el mismo tipo de distorsión (Fig. 3), el problema inicial se produjo antes de que los analitos comenzaran a migrar por la La causa más común de este tipo de distorsión de los picos es una frita parcialmente bloqueada o un vacío en la cabeza de la columna. Si las partículas de la muestra, las juntas de lla bomba desgastadas o la fase móvil llegan a la columna, suelen acumularse en la frita. Este material puede distorsionar la distribución de la muestra en la entrada de la columna, de manera que una parte de la muestra llega a la columna por una vía de flujo diferente y, por tanto, más tarde que otra parte de la muestra. Como no se ha producido ninguna separación en este punto, todos los analitos se distorsionan de la misma manera y el cromatograma muestra una cola de pico o una distorsión similar para todos los picos.

 

Posibles soluciones:

a) Filtrar la fase móvil y las muestras con filtros de 0,22 o 0,45 um

b) Cambiar periódicamente las juntas de la bomba

c) Utilizar un filtro en línea

 

 

1.4. Los picos mal resueltos pueden hacerse pasar por un problema de la columna o del buffer. Si dos picos se resuelven sólo parcialmente, puede producirse una división o duplicación de los picos. Esto se observa en la figura 4. En la figura 4a, se observó una distorsión de los picos, muy parecida a la de la figura 3, lo que sugiere una frita bloqueada. El cambio de la columna no corrigió el problema, por lo que era poco probable que la frita estuviera bloqueada. Cuando se redujo la masa de la muestra en la columna (Fig. 4b), el pico se parecía más a dos picos que a un hombro. Esto condujo a una mayor investigación y se determinó que había un segundo pico. Se modificaron las condiciones del método para separar completamente los dos picos.

 

1.5. Los picos frontales son un fenómeno bastante raro de encontrar en las columnas actuales bien empaquetadas. Una fuente de picos frontales es la canalización en la columna o colapso de la estructura de la columna. Esto es poco frecuente en la actualidad si se utilizan en las condiciones recomendadas por el fabricante.

La mayoría de las columnas de sílice son estables en el rango de pH 2-8. Por debajo de pH 2, la fase enlazada se hidroliza; por encima de pH 8, la sílice puede disolverse. Si usted opera el sistema HPLC fuera de este rango de pH, asegúrese de seleccionar una columna que esté diseñada para ser estable bajo las condiciones seleccionadas.

 

 

Posibles soluciones:

a)  Utilizar la columna en el rango de pH 2-8

b) En caso de ser necesarias otras condiciones elegir una columna para alto o bajo pH, o también para alta concentraciones de agua. Existen columnas especificas para dichos usos.

 

2.  Variación en la retención

Cuando todos los picos cambian los tiempos de retención, lo más probable es que se deba a un cambio en la composición de la fase móvil, el relleno de la columna, la temperatura de la columna o el caudal. Los errores en la mezcla en línea de las fases móviles isocráticas o de gradiente también pueden causar problemas de tiempo de retención. A continuación se examina brevemente cada una de estas fuentes.

 

2.1 Los cambios en la composición de la fase móvil suelen producirse de forma brusca cuando el analista realiza un cambio, ya sea por un ajuste incorrecto de la mezcla de la fase móvil con un sistema de mezcla en línea o por la sustitución de la fase móvil por un nuevo lote que no se ha preparado correctamente. En raras ocasiones, puede producirse una pérdida selectiva (por ejemplo, por evaporación) de un componente de la fase móvil. Cuando se realiza un cambio de fase móvil, los picos suelen moverse en la misma dirección -a tiempos de retención más cortos o más largos- y la retención relativa (el factor de selectividad, a) suele

Posibles soluciones:

a)  Revisar los ajustes del sistema y preparar nueva fase móvil en caso que sea necesario

b) Probar la columna en otro equipo para descartar un problema en ella.

c)  Verificar el correcto funcionamiento del equipo

 

2.2 Los cambios químicos de la columna se producirán a lo largo de su vida útil y, por lo general, son graduales a lo largo de varias semanas o meses. El envejecimiento de la columna suele ir acompañado de un aumento de la contrapresión de la columna, de un cambio gradual de los tiempos de retención (más largos o más cortos) y de un aumento de la cola de los picos. Cambie la columna por una nueva para confirmar un problema de envejecimiento de la Una vida útil de la columna de entre 500 y 2000 inyecciones debería considerarse satisfactoria.

 

Posibles soluciones:

c)  Verificar las condiciones de uso para la columna en cuestión, si corresponde con sus características.

 

2.3 Los cambios de temperatura de la columna pueden provocar cambios en el tiempo de retención de entre un 1% y un 3% por cada cambio de temperatura de 1°C. Cuando no se utiliza un horno de columna (es decir, en condiciones “ambientales”), la temperatura suele variar a lo largo del día (y de la noche) debido a los cambios de temperatura del laboratorio.

 

Posible solución:

d) Utilice un horno de columna o controle la temperatura ambiente con frecuencia.

 

2.4 Los problemas de caudal pueden deberse a burbujas, fugas o problemas de la Los problemas de burbujas se correlacionarán con una presión baja o fluctuante y un aumento de los tiempos de retención. Con bombas de dos cabezales, el flujo y la presión pueden pulsar si hay una burbuja en un solo cabezal de la bomba.

 

Posibles soluciones:

a)  Desgasificar la fase móvil y purgar el sistema con un flujo de 5-10 ml/min

b) En caso de persistencia del problema, utilizar Acetonitrilo o Metanol puro para el purgado

Las fugas también aumentarán los tiempos de retención. Busque accesorios que goteen o depósitos cristalinos en los accesorios como evidencia de fugas. Preste especial atención a los conectores situados aguas arriba de la columna. Los conectores y las juntas del interior del automuestreador pueden ser difíciles de inspeccionar; una linterna y un pequeño espejo pueden ser útiles. Si se utilizan conectores de acero      inoxidable, normalmente un giro de 1/4 de la tuerca del racor detendrá la fuga. En  el caso de los racores PEEK, es mejor detener la bomba, aflojar el racor, empujar el tubo hasta el fondo del puerto del racor y luego apretar el racor antes de volver a poner en marcha la bomba. Si se aprieta un racor de PEEK con el flujo en marcha, el tubo puede resbalar en el racor, creando volumen extracolumna, que puede degradar la separación. Otra fuente de fugas pueden ser las válvulas, en este caso, consultar con el servicio técnico del equipo.

 

Posible solución:

a)  Buscar posibles fugas en el equipo y en caso de ser necesario consulte con el servicio técnico.

 

3.   Picos fantasma

3.1. La elución tardía de los picos de una corrida anterior puede aparecer como picos inesperadamente amplios en las separaciones isocráticas. En las separaciones isocráticas, cuanto más largo sea el tiempo de retención, más ancho debería ser el pico, pero todos los picos de una región estrecha del cromatograma deberían tener aproximadamente la misma anchura de pico. Cuando aparece un pico amplio entre los estrechos, como en la figura 11 (flecha), lo más probable es que el problema proceda de un compuesto de dilución tardía de una inyección

 

Posibles soluciones:

a)  Extender el tiempo de inyección entre 2 y 3 veces o hasta verificar que el pico en cuestión haya salido.

b) Agregar un lavado con solvente fuerte al final de cada inyección

 

3.2. Los picos fantasma en los gradientes pueden aislarse ejecutando un gradiente en blanco sin inyección y observando la línea de base. Cuando aparece un número excesivo de picos en el gradiente en blanco, como en la figura 12a, una de las causas más probables del problema son los reactivos sucios. En este caso, los picos en la ejecución de la Figura 12a son bastante pequeños

(1-3 mAU), y sería poco preocupante para un ensayo de componentes principales de picos en el rango de tamaño de 0,8-1,0 AU, pero para los métodos indicadores de estabilidad o de impurezas, los picos en el rango de tamaño de 1-2 mAU pueden requerir cuantificación. En estos casos, se justifica una investigación adicional. Durante el equilibrio entre los recorridos del gradiente, las impurezas no polares de la fase móvil tienden a concentrarse en la cabeza de la columna.

Luego, durante el gradiente, estas impurezas se eluyen igual que cualquier otro pico en una carrera de gradiente. Compruebe el origen del problema ampliando el período de equilibrio tres veces. Si los picos del gradiente en blanco aumentan aproximadamente tres veces, el disolvente acuoso es la fuente más probable.

Sustituya el agua y/o los aditivos por componentes de mayor pureza para eliminar el problema, como en el caso de la figura 12b.

 

3.3. Los picos negativos en ejecuciones isocráticas o de gradiente son menos comunes que los picos positivos, pero pueden ocurrir. Los picos negativos son más comunes con el emparejamiento de iones u otros métodos en los que los reactivos de la fase móvil tienen una absorbancia UV significativa en la longitud de onda de detección seleccionada. En estos casos, la absorbancia de fondo puede ser significativa (quizás 0,5 UA o más), pero no se nota porque el sistema pone en cero automáticamente la señal del detector al principio de cada serie. Cualquier compuesto que tenga menos absorbancia que el fondo de la fase móvil aparecerá como un pico negativo. La identificación de la fuente y la eliminación de tales picos se realiza de la misma manera que los picos positivos: compruebe el agua, los reactivos o el proceso de preparación de la muestra.

 

Posible solución:

a)  Comprobar la calidad del agua y reactivos utilizados.

 

4.  Contrapresión en la columna

El aumento de la contrapresión de la columna es inevitable a medida que la columna envejece y la alta contrapresión es una de las causas más comunes de fallo de la columna. Sin embargo, algunas prácticas sencillas ayudarán a prolongar la vida de la columna, incluyendo el uso de filtros en línea (véase 4.2), cartuchos guardacolumnas (4.3) y el lavado regular de la columna (5.2)

 

4.1. Localizar los problemas de presión es un procedimiento sencillo. Si se utiliza un filtro en línea, es la fuente más probable de aumento de presión, por lo que comprobarlo primero puede ahorrar tiempo de resolución de problemas. De lo contrario, la forma más fácil de encontrar la causa del aumento de presión es aflojar sistemáticamente los conectores, empezando por la salida del HPLC y avanzando aguas arriba hacia la bomba. Debería esperar un cambio insignificante en la caída de presión a medida que se retira cada elemento sucesivo del sistema, con la excepción de la columna. Por ejemplo, si se retira el detector y luego la tubería que conecta el detector con la columna, no debería producirse una reducción significativa de la contrapresión, a menos que uno de ellos esté Cuando se retira la columna, por supuesto, la presión caerá – utilice la información histórica sobre la presión normal de la columna para averiguar si la columna es la fuente del problema. Una vez identificada la fuente del problema de presión, sustituya la tubería o haga un lavado a contracorriente de la parte obstruida(véase 5.2 para los procedimientos de lavado de la columna)

 

4.2. Los filtros en línea son una de las herramientas menos costosas y más eficaces para prolongar la vida útil de las columnas. Normalmente, estos filtros contienen una frita de 0,5 µm de porosidad y se montan justo después del automuestreador para atrapar cualquier partícula procedente de la fase móvil, la bomba, el automuestreador o la muestra. El filtro en línea no debe utilizarse para sustituir la filtración del disolvente u otras prácticas preventivas, sino que sirve como respaldo para proteger la columna. Cuando la contrapresión del sistema comience a aumentar, compruebe y/o sustituya la frita del filtro en línea. Recomendamos utilizar un filtro en línea en todos los sistemas, incluso cuando se utilice una columna de protección

 

4.3. Los cartuchos guardacolumna proporcionan una doble protección a la Si no se utiliza un filtro en línea, la frita de la cabeza del cartucho protector atrapará las partículas que, de otro modo, podrían ensuciar la frita de entrada de la columna. La fase estacionaria del cartucho de protección debe estar adaptada a la columna analítica para que atrape las sustancias que se adsorberían irreversiblemente a la columna analítica. Así, el cartucho de guarda actúa como elemento fusible en el sistema. Un aumento del 10% en la presión del sistema, que no se corrige con la sustitución del filtro en línea, es un buen indicio de que el cartucho de protección debe ser sustituido, al igual que una caída del 10% en la eficiencia o resolución de la columna. La figura 13 muestra un ejemplo de la eficacia de los cartuchos de protección en la protección de la columna analítica.

 

 

4.4. La precipitación de buffer es una causa común de aumento de la contrapresión, especialmente en la cromatografía de fase reversa con altas concentraciones de disolvente orgánico en la fase móvil. Para intentar eliminar el buffer precipitado dentro de una columna, invierta la columna y bombee entre 20 y 40 volúmenes de columna de agua al 100% a través de la columna, inicialmente con un flujo reducido (nota: si el buffer se ha precipitado en toda la columna esto puede no ser posible). Si esto tiene éxito, restablecer la columna a la  dirección correcta de flujo y lavar durante 10-20 volúmenes de columna con agua/ fase móvil orgánica 50:50, seguido de otros 10-20 volúmenes de columna de fase móvil 100% orgánica, y finalmente reequilibrar en las condiciones deseadas.

Para evitar que se repita, compruebe que la fase móvil es compatible con la concentración de buffer utilizada y reduzca la fuerza iónica si es necesario. Considere la posibilidad de aumentar el porcentaje de agua y también de premezclar la fase móvil. En las separaciones en fase reversa, evite los cambios rápidos de la fase móvil que contiene tampón al 100% de disolvente orgánico (por ejemplo, MeOH, ACN).

 

5.  Cuidado de la columna

Las columnas deben considerarse un elemento consumible y, como tal, tendrán una vida útil limitada. En la mayoría de las aplicaciones, las columnas deberían durar entre 500 y 2000 inyecciones, pero esto variará en función de la limpieza de las muestras, el pH de la fase móvil y el uso de cartuchos de protección. Las prácticas enumeradas aquí deberían ayudar a maximizar la vida útil de las columnas de sílice.

 

5.1. El equilibrio de la columna cuando se cambia de una fase móvil a otra, o cuando se recicla un gradiente, debe tomar de 10 a 20 volúmenes de columna. A continuación se muestra el volumen de la columna para varias dimensiones de Cuanto menos drástico sea el cambio de disolvente (por ejemplo, de 80% a 20% de ACN/agua frente a ACN a THF), menos volumen se necesitará. La forma más fácil de comprobar el equilibrio es realizar dos inyecciones de muestra: si la retención es la misma, la columna se ha equilibrado adecuadamente; si la retención se desplaza, aumente el volumen de equilibrio y vuelva a intentarlo. El equilibrio está relacionado con el volumen de disolvente, no con el tiempo, por lo que un mayor caudal puede reducir los tiempos de equilibrio.

 


5.2. El lavado habitual de la columna es un procedimiento sencillo que puede prolongar la vida útil de la columna mediante el lavado del material fuertemente retenido en Al final de cada día de uso de la columna, elimine cualquier tampón (véase 4.4.) y luego lave la columna con el 100% del disolvente fuerte (generalmente ACN o MeOH para los métodos de fase reversa deshidratación de la fase impedirá una buena limpieza y el reequilibrio de la columna con la fase móvil puede ser muy lento.

 

Lavado para regeneración de la columna

Siga este procedimiento general para el lavado de la columna con los disolventes específicos mencionados a continuación para su tipo de columna. Siempre es bueno comprobar las recomendaciones del fabricante antes del lavado para no dañar la columna.

  1. Desconectar e invertir la columna
  2. Conecte la columna a la bomba, pero no al detector
  3. Lavar con 10-20 volúmenes de disolvente en la columna a un caudal no superior al utilizado para el cromatograma de control de calidad
  4. Si se modifican los procedimientos siguientes, asegúrese de utilizar disolventes miscibles para cada paso sucesivo (véase la tabla de la página 24)

5.2.1 Columnas de fase reversa (C18, C8, C4, Fenil, CN, tipo “AQ”)

  1. Fase móvil sin tampón
  2. MeOH o ACN

Si se cree que los iones metálicos son la causa de la contaminación, se debe lavar con EDTA acuoso 0,05M, luego con agua, seguido de la secuencia anterior. Las columnas que utilizan reactivos de emparejamiento de iones deben estar dedicados a las aplicaciones de emparejamiento de iones.

5.2.2. Columnas de proteínas/péptidos en fase reversa

  1. Fase móvil sin tampón
  2. Gradiente de 10-90% B; A = 0,1% TFA/agua; B = 0,1% TFA/ACN

5.2.3. Columnas de sílice sin aglutinar (SIL)

  1. IPA
  2. MeOH
  3. Acetato de etilo

5.2.4. Columnas de fase normal enlazadas (CN, NH2 , Diol)

  1. Cloroformo
  2. IPA
  3. Cloruro de metileno
  4. Hexano

5.2.5. Columnas de intercambio aniónico (SAX, WAX)

  1. Agua
  2. Metanol
  3. Cloroformo
  4. Metanol
  5. Agua

5.2.6. Columnas de intercambio catiónico (SCX, WCX)

  1. Agua (inyectar 4x 200 µL de DMSO durante el lavado)
  2. THF

5.2.7. Columnas de exclusión por tamaño para proteínas Para proteínas débilmente retenidas

Tampón fosfato 0,1M, pH 3 Para proteínas fuertemente retenidas

  1. Gradiente de 100% de agua a 100% de ACN en 60 min.

 

5.3. Las prácticas de almacenamiento de la columna ayudarán a prolongar su vida útil. El procedimiento de almacenamiento más sencillo consiste en eliminar cualquier buffer de la columna (véase el apartado 4.4.) y, a continuación, lavar la columna con 10-20 volúmenes de columna de disolvente de fase móvil fuerte (por ejemplo, MeOH o ACN para la fase reversa, como se detalla en el apartado 5.2) para eliminar el material fuertemente retenido en la columna. A continuación, enjuague la columna con otros 10-20 volúmenes de fase móvil de almacenamiento especificados por el fabricante (esta información debe figurar en el cromatograma de prueba de control de calidad suministrado originalmente con la columna). Por último, tape la columna de forma segura para evitar la evaporación de la fase móvil.

Salvo en casos específicos en los que el fabricante de la columna recomiende lo contrario (por ejemplo, algunas columnas de intercambio iónico), no almacene las columnas con buffer o con menos de un 25% de disolvente orgánico para evitar el crecimiento microbiano.

 

6.  Resumen

Se han examinado varias causas comunes de problemas de forma de los picos, variación del tiempo de retención, picos fantasma y contrapresión de la columna. Algunos de estos problemas tienen su origen en la muestra, otros en la fase móvil y otros en la columna u otros componentes del instrumento. Algunos buenos hábitos ayudarán a minimizar la aparición de estos problemas.

  • Utilice una nueva columna de sílice de tipo B de alta pureza para cada nuevo proyecto y acompáñela de reactivos de alta calidad para
  • Lave el sistema de HPLC con regularidad para eliminar las sales y los tampones y realice el mantenimiento del sistema de forma periódica para minimizar los problemas con las válvulas de retención y los sellos de las Cuanto más exhaustivo sea el proceso de limpieza de la muestra, más limpia estará la muestra y se reducirá la probabilidad de que surjan problemas relacionados con la misma.
  • Al final de una serie de pasadas (o después de cada pasada, en algunos casos), un lavado con disolvente fuerte ayudará a eliminar los materiales fuertemente retenidos en la columna, a minimizar las interferencias en futuras pasadas y a prolongar la vida útil de la columna.

Las columnas no duran para siempre, pero con un cuidado adecuado, debería poder obtener un buen rendimiento.

Más información:
www.omnilab.com.ar