Por lo general, los materiales de cromatografía fabricados a partir de sílice se consideran estables en un rango de pH 2 a pH 8, y las separaciones y purificaciones usualmente se realizan bajo dichas condiciones. Sin embargo, existen aplicaciones donde podría utilizarse un pH más elevado para lograr mejores purificaciones y alcanzar mayor pureza y/o rendimiento. Los materiales de fase estacionaria EternityXT son ideales para los laboratorios que necesitan operar con un rango extendido de pH, dado que mantienen su estabilidad en condiciones de pH bajo y alto.

La extensión del pH a condiciones más alcalinas puede mejorar la selectividad y la resolución entre el principal compuesto de interés y sus impurezas, aumentar la carga y productividad de la amina, por ejemplo, que contiene sustancias en las que el pH >8 podría resultar beneficioso.

Se analizó la estabilidad química del material EternityXT durante un periodo prolongado y se la comparó con los materiales de sílice más comunes del mercado en la actualidad, analizando el cambio en k’ con el tiempo para fenantreno a elevada temperatura, utilizando 10mM de buffer de carbonato con un pH de 10,5. Los resultados se muestran en la Figura 1. La figura describe los cambios de k’ en función del tiempo para: Kromasil EternityXT 10 μm C18, C8 y C4, así como Kromasil 10 μm C18 y material C18 de la competencia. Los materiales EternityXT muestran una estabilidad química muy elevada a lo largo del estudio independientemente de la derivatización. Aun así, Kromasil EternityXT C18 y C8 permanecen sin cambios en todo el estudio, C4 experimenta una leve disminución de k’ con el tiempo, pero el %k’ varía solo en 5% dentro de las 120 horas bajo condiciones exigentes.

Como es de esperar, los materiales de sílice tradicionales poseen menor estabilidad química a un pH de 10,5. De todos modos, Kromasil C18 de 10 μm ha demostrado una capacidad química superior más allá de su rango de pH operativo tradicional, que se refleja en los resultados presentados en la Figura 1.

Figura 1: Estabilidad química de los materiales C18 de 10 μm con elevado pH y altas temperaturas.

A fin de representar en mayor detalle la estabilidad química de los materiales Kromasil EternityXT, la Figura 2 muestra cromatogramas analíticos que estudian la hidrólisis para una de las fases. Estos son cromatogramas basados en inyecciones analíticas de Kromasil EternityXT C18 de 10 μm con 12 horas de hidrólisis entre cada inyección. El cromatograma superior corresponde al inicio del estudio y el cronograma inferior representa el último resultado del ensayo. Los resultados aquí mostrados indican que k’ permanece constante para todos los compuestos de la mezcla de la muestra. Es importante destacar que se utilizó el mismo vial de muestras para este estudio. Como es sabido, el tolueno es un compuesto volátil, y si bien el tiempo de retención del tolueno se mantiene durante el estudio, su altura de pico y área de pico disminuyen con el tiempo, debido a la evaporación del compuesto en el vial de la muestra. Finalmente, estos resultados revelan que Kromasil EternityXT C18 de 10 μm no se modifica durante la hidrólisis, lo que confirma la estabilidad química del material.

Figura 2: Resultados cromatográficos analíticos del estudio de hidrólisis de EternityXT C18 de 10 μm con alto pH y altas temperaturas.

Al igual que las pequeñas bases orgánicas que han mostrado alcanzar una mejor separación, resolución y carga a elevado pH, ciertas separaciones y aislamientos de péptidos pueden mejorar si se realizan bajo condiciones de pH básico. La Figura 3 ilustra la purificación de un péptido de 3,5 kDa a un pH 8, que generalmente utiliza material de sílice clásico, y su comparación con un pH 9,5 utilizando EternityXT. Como se muestra en la Figura 3, la pureza y el rendimiento son superiores cuando la purificación se realiza a un pH más elevado.

Este estudio ha demostrado que la sílice Kromasil EternityXT reforzada con organosilano funcionalizado con C4, C8 y C18 posee una elevada resistencia química bajo condiciones alcalinas extremas al tiempo que mantiene un alto rendimiento. Dicha estabilidad a pH elevado expande el rango operativo frente a la necesidad de separar y purificar compuestos como sucede en el ejemplo del péptido aquí descripto.

Figura 3: Purificación de péptido a alto pH

ACERCA DE KROMASIL ETERNITY

Kromasil EternityXT es una familia de fases estacionarias única en su tipo, que incorpora tecnología de purificación de vanguardia. Los materiales a granel Kromasil EternityXT satisfacen sus necesidades de cromatografía preparativa, incluso bajo condiciones extremas, donde la estabilidad química y mecánica del material podrían estar en juego.

Diseño para una prolongada vida útil

La reconocida familia de productos EternityXT se basa en tecnología patentada que le permite al material operar bajo condiciones extremadamente exigentes, incluido un amplio rango de pH y condiciones de “limpieza en el lugar” (CIP en inglés) normalmente utilizadas para los materiales a base de polímeros. Las fases estacionarias de Kromasil EternityXT pueden utilizarse superando la ventana de pH de los materiales Kromasil Classic, reconocidos por su estabilidad mecánica y química para una variedad de aplicaciones en todo el mundo.

Familia de fases estacionarias Kromasil EternityXT

Kromasil EternityXT es el material de elección de sílice orgánica/inorgánica químicamente estable para la purificación de productos farmacéuticos, péptidos y oligonucleótidos bajo cromatografía preparativa de fase reversa. Esta sílice reforzada posee una estabilidad química extraordinariamente alta, mantiene los beneficios de la reconocida sílice Kromasil Classic y brinda un excelente poder de separación como así también capacidad de carga a pH bajo, medio y alto desde el aislamiento de impurezas hasta la purificación a gran escala. Los materiales a granel Kromasil EternityXT sometidos al proceso de “end-capping”, se suministran tanto en derivaciones C18 como C8, proporcionando la flexibilidad necesaria para cromatografía preparativa a pequeña y gran escala.

*Visite kromasil.com para consultar combinaciones de partículas y fases disponibles.

Derivatizaciones de Kromasil EternityXT 10 µm para purificación

Kromasil EternityXT C18 y C8 brindan opciones de fase estacionaria para purificar los componentes principales y aislar las impurezas, dependiendo de la hidrofobicidad de la muestra y permitiendo operar libremente a lo largo de casi todo el rango de pH. Debido a que un gran volumen de principios activos farmacéuticos (API) que se purifican en la actualidad son básicos por naturaleza, es posible operar bajo fuertes condiciones básicas con estas fases a fin de aumentar la carga en la columna, mejorar la productividad y así reducir los costos totales de purificación. Otros compuestos como péptidos y oligonucleótidos también se pueden beneficiar de métodos de purificación con elevado pH.

Estabilidad de avanzada

La evaluación de la estabilidad mecánica y química es uno de los pilares del desarrollo de las fases estacionarias de Kromasil. Los materiales Kromasil EternityXT para cromatografía preparativa han sido diseñados para cumplir con requerimientos específicos, en los que el material se ha expuesto a distintos procesos de hidrólisis y condiciones de “limpieza en el lugar”.

Estabilidad química de largo plazo

Las siguientes figuras muestran la estabilidad química de largo plazo a bajo y alto pH. Las condiciones de bajo pH simulan un uso de muy largo plazo, aplicando una elevada temperatura de 80° C, y una fase altamente acuosa, 95% de agua, con 0,1% de TFA (ácido trifluoroacético), pH ≈ 1,9. Los materiales EternityXT muestran excelente estabilidad con un mínimo desplazamiento de k’ en función del tiempo.

Las condiciones de elevado pH incluyen un buffer de bicarbonato altamente acuoso a pH 10,5 y elevada temperatura de 60° C. Se ha demostrado que el buffer de bicarbonato es especialmente agresivo cuando se utiliza con materiales a base de sílice, pero tiene poco efecto en el factor de retención en EternityXT, debido a la densa derivatización y plataforma de EternityXT, que protegen la matriz de sílice.

Estabilidad química. Condiciones CIP

Es posible higienizar o regenerar Kromasil EternityXT C18 y C8 en columna (CIP), incluso con 1M de NaOH, si es necesario. Las fases estacionarias de Kromasil EternityXT han revolucionado el mercado, dado que 1M de NaOH es el estándar en biocromatografía para el tratamiento de resinas poliméricas, pero ahora las barreras entre los materiales a base de polímeros y sílice comienzan a derribarse gracias a las características de la plataforma Kromasil EternityXT.

Rendimiento cromatográfico: Kromasil EternityXT versus material polimérico

Es sabido que los materiales a base de poliestireno-divinilbenceno (PS/BVB) exhiben una estabilidad química muy elevada a pH alto, permitiendo los procesos de limpieza, por ejemplo, para 1 M de NaOH. Sin embargo, el material no puede competir con los materiales a base de sílice en términos de rendimiento cromatográfico.

Con Kromasil EternityXT ahora es posible obtener el alto poder de separación asociado a los materiales a base de sílice, y al mismo tiempo conseguir elevada estabilidad química a un alto pH.

El gráfico compara los materiales a base de sílice y polímero: EternityXT y el líder del mercado en materiales PS/DVB, bajo idénticas condiciones. El cromatograma muestra la separación preparativa de insulina, donde se observa que el material a base de sílice, EternityXT, presenta picos marcadamente más pronunciados, mientras que el material PS/DVB solamente muestra casi un 50% de amplitud de banda. Tanto la eficiencia analítica como la capacidad de carga son significativamente mejores en EternityXT.

Disponibilidad

Kromasil EternityXT para aplicaciones preparativas posee un tamaño de partícula de 10 µm, tamaño de poro de 100 Å y derivatizaciones C18 y C8.

Más información:
http://www.chemicalcenter.com.ar