Análisis de cromatografía líquida simultánea HPLC y UHPLC de impurezas de acetaminofeno utilizando un solo instrumento

Maria Grübner, Carsten Paul, Frank Steiner
Thermo Fisher Scientific, Germering, Germany

Objetivo

Para demostrar las capacidades del sistema Thermo Scientific ™ Vanquish ™ Flex Duo UHPLC para Dual LC para funcionar HPLC independiente y métodos UHPLC simultáneamente utilizando un instrumento.

Beneficios de la aplicación

• La tecnología LC dual proporciona dos canales LC independientes ocupando el espacio de un solo instrumento.
• Los métodos de HPLC establecidos y sus contrapartes UHPLC pueden implementarse en paralelo en el mismo instrumento.

Introducción

En los laboratorios analíticos actuales, un gran número de métodos analíticos generalmente se establecen y utilizan para el análisis de cientos de muestras.

Para aumentar el rendimiento y generar más resultados, existe una creciente necesidad de métodos más rápidos y de instrumentación analítica adicional. Por lo tanto, los instrumentos compatibles con UHPLC y las restricciones de espacio juegan un papel cada vez más importante en el equipamiento de estos laboratorios. Con respecto a esto , los sistemas LC que albergan dos canales LC independientes con dos trayectorias de flujo separadas, configurables individualmente en un solo instrumento, son beneficiosas de múltiples maneras. Por ejemplo, el sistema Vanquish Flex Duo recientemente desarrollado para LC dual, permite la optimización de cada canal de flujo,con  respecto a los volúmenes de retardo de columna o gradiente adicionales, dando la oportunidad de tener un instrumento HPLC y un instrumento UHPLC , en un solo equipo.

Tal configuración se puede utilizar para la implementación paralela de métodos HPLC y UHPLC completamente independientes, pero también para acelerar los métodos heredados de HPLC en la misma estación de trabajo. Esta aplicación demuestra el último caso.

Aquí, el canal cromatográfico izquierdo del novedoso sistema Vanquish Flex Duo para LC dual se configuró con volúmenes de Sistema standard de HPLC (consulte la sección de instrumentación) y se corrio  con una columna de diámetro interno de 4,6 mm y tamaño de partículas de 3 µm para el análisis de acetaminoféno como ingrediente farmacéutico activo (API) y sus impurezas derivadas de un ensayo USP.1 Los volúmenes del sistema se redujeron en el canal derecho por el metodo UHPLC respectivo, desarrollado con el sistema de datos de cromatografía Chromeleon ™ (CDS) 2 el cual se ejecutó en paralelo,  con una columna de  i.d. de 2.1 mm y tamañao de partículas de 1.9 µm.

Ambos análisis se realizaron con la fase estacionaria Thermo Scientific ™ Hypersil GOLD ™ C8 de diferentes dimensiones segun USP L7 y muy adecuado para analitos de hidrofobicidad media.

Experimental

Reactivos y materiales

• Agua desionizada, 18.2 MΩ · cm de resistividad o superior
• Fisher Scientific ™ Metanol Optima ™, grado LC / MS (N/P 10767665)
• Fosfato sódico dibásico anhidro Fisher Scientific (P/N 10182863)
• Fosfato de Potasio monobasico Fisher Scientific (P/N 10429570)
• Acetaminoféno, 4-aminofenol, N- (4-hidroxifenil) propanamida (Impureza B), 2-acetamidofenol (Impureza C), acetanilida (Impureza D) y 4′-cloracetanilida (Impureza J) se compraron a proveedores acreditados..

Preparación de Muestra

Las soluciones madre de acetaminofeno (20 mg / ml), 4-aminofenol y las impurezas B, C, D y J (1 mg / ml cada una) se prepararon en metanol. Por dilución con metanol y mezcla de soluciones madre, se preparó una muestra que contenía 10 mg / ml de acetaminofeno y 10 µg / ml de cada uno de los otros compuestos (correspondientes al 0, 1% de la API).

Instrumentación

Sistema Vanquish Flex Duo para LC dual compuesto por:

• Base del sistema Vanquish Dual (N/P VF-S02-A-02)
• Bomba Dual F (N/P VF-P32-A-010)
• Bomba izquierda con mezclador estático, volumen 350 µL (N/P 5310)
• Bomba derecha con mezclador estático, volumen 150 µL (N/P 5110)
• Inyector Split Sampler FT (N/P VF-A40-A-020)
• Compartimiento de Columna H (N/P VH-C10-A-020)
• Detector de longitud de onda variable en la trayectoria de flujo izquierda (N/P VH-D40-A0)
• Con celda de flujo estándar, 10 mm, 11 µL (N/P 0250)
• Detector de longitud de onda variable en la trayectoria de flujo derecha (N/P VH-D40-A0)
• Con celda de flujo semi-micro, 7 mm, 2.5 µL (N/P 0360)

Procesamiento de datos y software

Se utilizó el software Chromeleon CDS versión 7.2.8 para la adquisición y análisis de datos.

Resultados y discusión

La Figura 1 ilustra la configuración fluídica esquemática del sistema Dual LC utilizado en este estudio.

Los parámetros del método del canal UHPLC de este experimento se derivaron del método HPLC original mediante la herramienta de aceleración Chromeleon CDS UHPLC con un factor de impulso de 1,52 para un caudal de 0,5 ml / min y un tiempo de descarga adicional para garantizar un equilibrio suficiente. En ambos canales cromatográficos se corrieron 10 inyecciones repetidas de la muestra . La Figura 2 muestra dos ejemplos de cromatogramas con resoluciones promedio (Rs) que cumplen con los requisitos de la USP.1 La Tabla 2 resume los tiempos de retención (tR) y su precisión. Las desviaciones estándares absolutas y relativas (SD y % RSD) de los tiempos de retención son comparables para ambos métodos.

Con respecto a la precisión del área de pico y los valores de señal  ruido (S / N), el método UHPLC fue inferior al método HPLC debido a dos impactos (ver Figura 3, barras azules y rojas). Por un lado, la sensibilidad a los rayos UV se ven afectados por la longitud de la ruta de luz proporcionada por la celda de flujo, que es un 30% más corta para la configuración UHPLC. Además, la precisión de inyección (y, por lo tanto, el área% RSD) se ve afectada negativamente por el muy bajo volumen de inyección de 0.17 µL en el método UHPLC a medida que se acerca al límite de especificación del inyector automático. Debido a la reducción de escala del menor volumen de la  columna de  UHPLC este pequeño volumen de inyección resulta del cálculo automático de parámetros por la calculadora de aceleración Chromeleon CDS que se origina en un volumen de inyección ya pequeño de solo 1 µL que tuvo que aplicarse en el método original de HPLC. En el modo HPLC, los volúmenes de análisis superiores a 1 µL causaron formas de pico distorsionadas para el 4-aminofenol de elución temprana debido a la alta resistencia de elución del metanol solvente de la muestra y a la mezcla insuficiente en la columna previa en los bajos volúmenes del sistema. En contraste con una forma de pico frontal en HPLC para inyección de 3 µL, triplicar el  volumen de inyección reducido no causó ninguna alteración pico para el método UHPLC ya que el volumen de muestra de 0.5 µL es lo suficientemente pequeño como para mezclarse adecuadamente con el entorno de la fase móvil antes de ingresar a la columna. Ambos casos se ilustran en la Figura 4 y demuestran claramente la ventaja del método UHPLC para la capacidad de carga de volumen de muestra. Por lo tanto, se recomienda una mejora simple del método UHPLC al aumentar el volumen de inyección de 0.17 µL a 0.5 µL para mejorar S / N y rendimientos% de área de RSD en un rango similar al método HPLC, que también se muestra en la Figura 3, amarillo barras. Sin embargo, los tres métodos dieron como resultado picos bien integrables con valores de S / N mayores a 50.

Los beneficios considerables del método UHPLC son ahorros sustanciales en el volumen de muestra, el consumo de solvente, y tiempo de ciclo (tc), con capacidades de optimización adicionales si el volumen de retardo de gradiente y, por lo tanto, el tiempo de equilibrio se reducen aún más, por ejemplo, configurando el sistema Dual LC con una bomba mezcladora de alta presión (HPG) para la ruta UHPLC. Otra opción para aumentar el rendimiento y ahorrar costos y tiempo es la eliminación del primer paso isocrático de la tabla de gradiente, ya que la columna experimenta un paso isocrático suficientemente largo debido al retraso del gradiente. Los respectivos cromatogramas UHPLC se representan en la Figura 5, y se puede deducir que la resolución del par crítico (pico 3 y 4) se mejora (Rs = 3). Con este método, el tiempo de ejecución podría acortarse en otros 1.2 minutos sin comprometer el% de área de RSD o S / N (ver Figura 6)

Conclusión

• El sistema Vanquish Flex Duo para LC dual brinda la oportunidad de tener un canal HPLC y un canal UHPLC en un solo sistema, ambos trabajando independientemente uno del otro.
• La aceleración de los métodos de HPLC para pasar a UHPLC se puede realizar fácilmente en la misma estación de trabajo. Ambos canales también se pueden usar de forma independiente para análisis separados.

En comparación con el análisis de HPLC, el método UHPLC optimizado (sin paso isocrático, volumen de inyección de 0,5 µL) dio como resultado un 50% de muestra, 80% de solvente y 60% de ahorro de tiempo y una mejora del rendimiento de 2.5 veces (Figura 7). Cien muestras podrían analizarse durante un día laboral de 8 h por UHPLC en lugar de más de 20 h. Suponiendo costos de $ 25 por litro de solvente más 10% para eliminación, el cambio a UHPLC implica un ahorro de costos de alrededor de $ 27 por 100 muestras o $ 5400 por año (con una estimación de 20,000 muestras por año).

• En el estudio actual, se logró un aumento del rendimiento de 2.5 veces y ahorros de hasta 80% de fase móvil y 60% de tiempo de ciclo al acelerar un método de HPLC a condiciones de UHPLC.

Referencias

1. Farmacopea de los Estados Unidos USP40-NF35 S1, Método de acetaminoféno Convención de la Farmacopea de los Estados Unidos, 2017.

2. Franz, H .; Fabel, S .: Nota técnica científica Thermo Fisher 75: Una herramienta universal para la transferencia de métodos de HPLC a UHPLC, 2016, https://assets.thermofisher.com/ TFS-Assets/CMD/Application-Notes/TN-75-HPLC-UHPLC-Universal-Tool-Method- Transfer-TN70828-EN.pdf (consultado el 5 de diciembre de 2017).

Para uso exclusivo en investigación. No debe utilizarse en los procedimientos de diagnóstico.

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