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¿Cómo debe ser el Espectrómetro Raman actual?

La Espectroscopia Raman es una técnica óptica en la cual la muestra a estudiar es incidida, (excitada), con un haz láser, para analizar luego la energía dispersada por dicha muestra. La espectroscopia Raman observa a la interacción entre la luz de excitación del láser y las uniones covalentes dentro de las moléculas de la muestra. Raman puede brindar información molecular detallada de la muestra si bien las uniones que estarán mejor representadas tienden a ser la uniones altamente simétricas que se encuentran comúnmente en la estructura molecular.

Raman también es muy sensible a mínimos cambios en el ángulo y fuerza de la unión, lo que lo hace un medio excelente para distinguir entre pequeños cambios en la estructura, morfología y en algunos caso aun de la temperatura. Raman no es una técnica elemental y no proveerá ninguna información en materiales que no tengan componentes con uniones covalentes.

Raman suministra información que es útil para la identificación de materiales desconocidos. El espectro Raman puede servir como una “huella digital molecular” y puede ser contrastada con una base de datos de espectros Raman para identificar el material.

En este caso el usuario podrá necesitar más conocimientos para la interpretación espectral, sin embargo, en algunos casos un simple análisis tal como la verificación de que el proceso efectuó o no el cambio deseado, se puede hacer comparando con un espectro de referencia.

Raman es una excelente herramienta para detectar y referenciar cambios de morfología debido a cambios de fase o efectos de tensión como resultado de cambios en la energía de las uniones a los cuales el Raman es muy sensible.

Algunos campos de aplicación de la Espectroscopia Raman:
• Hidrocarburos insaturados, aromáticos, productos farmacéuticos, polímeros, y materiales biológicos.
• Aceites comestibles y grasas.
• Relación entre saturación e insaturación en las cadenas ácidas y en la relación Cis-Trans de los isómeros en materiales insaturados.
• Análisis de packaging.
• Puede monitorear rápidamente la hidrogenación de aceites de semilla que producirían cambios indeseables en el producto final (industria de la alimentación y surfactantes).
• La industria farmacéutica se beneficia por la habilidad de Raman de diferenciar isómeros.
• En Biotecnología, en la elucidación de la estructura y reactividad de aminoácidos, estudio de complejos antígeno-anticuerpo, y el estudio de la sangre a nivel celular.
• Química forense, las muestras pueden ser muy pequeñas, y no requieren tratamiento
previo.
• Gemología y Geología
• Restauración de obras de arte.

Tradicionalmente la espectroscopia Raman ha sido terreno para individuos altamente calificados y hábiles en óptica. En los primeros días de Raman muchos usuarios construían sus propios instrumentos, y algunas personas que trabajan en áreas especializadas aún lo continúan haciendo hoy en día.

La mayoría de los instrumentos Raman comerciales apelan a los mismos grupos de espectroscopistas Raman que fabricaban sus propios sistemas. La compra de un instrumento completo ofrecía a estos individuos la conveniencia de no gastar demasiado tiempo en encontrar y armar los sistemas ellos mismos.

En general eran plataforma ópticas “abiertas” que ofrecían al usuario la flexibilidad que buscaban, pero por supuesto también requería que el usuario poseyese un gran conocimiento y la habilidad para operarlos. La instrumentación ha evolucionado con los años, pero aún así muchos instrumentos comerciales siguen siendo dirigidos a este mismo grupo de usuarios tradicionales de Raman.

En contraste, la mayoría de las personas que actualmente buscan instrumentos Raman no son espectroscopistas full-time, sino investigadores en una variedad de campos que ven Raman como una herramienta que ofrece oportunidades para mejorar su investigación primaria. A éstos usuarios realmente les encantaría la posibilidad de simplemente colocar la muestra en el instrumento y obtener resultados aplicables a su investigación. La mayoría no están interesados en “personalizar” la óptica del sistema y preferirían no tocar nunca dicha óptica.

Infortunadamente, la mayoría de los instrumentos Raman del mercado, no se condicen con las necesidades de estos nuevos investigadores. Algunos han visto suficiente valor en lo que Raman tiene para ofrecer e invierten el tiempo necesario para desarrollar la expertise necesaria, y otros han decidido que no valía la pena la complejidad y procuran sistemas Raman modernos.

La alternativa de diseño actual ha sido pensada para las necesidades de los investigadores que simplemente necesitan aplicar esta técnica, generar resultados rápidamente y aplicarlos a su trabajo primario. Esto significa una curva de aprendizaje muy corta y una operación muy simple, así como un sampling versátil y elevada performance junto con la confianza en los datos generados y también la obtención no solo de los datos sino también las respuestas necesarias. Por supuesto que un sistema así debería ser confiable y con un mínimo esfuerzo de mantención, así como no debería requerir un técnico dedicado para mantenerlo funcionado, o requerir varios días de trabajo para reconfigurarlo para diferentes experimentos. Resumiendo, la filosofía de un sistema moderno es que debe ser una herramienta para avanzar en la investigación en vez de algo que sea el eje de la investigación.

Breve introducción a la Espectrometría Raman:
Los espectrómetros Raman del presente son mucho más capaces que antes.
Las innovaciones en la tecnología de filtros, láser y CCD han producido una gama de instrumentos que son rápidos, sensibles y robustos.

Esto son buenas nuevas debido a que los científicos son constantemente bombardeados con problemas complejos y desafiantes y requieren la máxima performance de sus instrumentos.
Los sistemas Raman modernos proveen algoritmos avanzados e “inteligentes” que son de considerable ayuda en la optimización de los parámetros operativos del instrumento.

Inevitablemente, sin embargo, están aquellos que desean comprender la operación del instrumento más allá de la operación automática y aprender más sobre la interacción de los varios seteos del mismo. Este artículo presenta las mejores prácticas para aquellos que deseen entender mejor los parámetros del espectrómetro Raman.

Se presentarán algunos aspectos claves de los sistemas Raman Dispersivo y consejos sobre las mejores prácticas para permitir resultados óptimos, incluyendo: potencia del láser, apertura, número de exposiciones, foco de la muestra y manejo del background.

Al final habrá una discusión sobre el rechazo de rayos cósmicos, fotoblanqueo, alineación y calibración.

Mejores Prácticas

Potencia del Láser
La potencia de la señal Raman es directamente proporcional a la potencia del láser Raman (mW) que excita la muestra. Debería estar claro que cuanta más potencia se use, mayor será la señal Raman. Esta es la razón por la cual la mejor práctica es usar la potencia máxima del láser en tanto sea posible.

Una desventaja de esta recomendación es que algunas muestras se pueden quemar cuando son expuestas a la potencia total del láser. Generalmente estas muestras son de color oscuro o poseen bandas de excitación cercanas a la longitud de onda de excitación. Con muestras valiosas, es recomendable disminuir la potencia del láser y verificar que no haya daños. Luego incrementar la potencia hasta percibir que no habrá daños a la muestra. Es además, importante la densidad de la potencia del láser sobre la muestra. Esto puede ser maximizado a través del uso de lo se conoce como láser de alto brillo, que permite un foco más estrecho debido a que un láser de alto brillo mejora el rendimiento de la dispersión láser para una potencia dada. A veces existe una línea muy fina entre maximizar la señal y quemar una muestra. Es preferible una medición exacta y un control muy fino de la potencia del láser a nivel de décimas de milivatios.

Los sistemas del tipo Raman DXR miden la potencia de salida exacta del láser y permiten un control fino, haciéndolo ideal para muestras tales como nanotubos de carbono y SERS (Surface-Enhanced Raman Scattering) que son muy sensibles a la potencia del láser.

Apertura
Otra consideración clave del hardware es la apertura del instrumento.
La apertura controla cuanta señal Raman pasa hacia el espectrógrafo y hacia el detector.
Su uso primario es la obtención de la resolución espectral. En algunos microscopios Raman también se habilita la operación confocal. Como regla general usar la apertura más grande tanto como sea posible. Por ejemplo, un slit (ranura) de 50 micrones.
Las aperturas son típicamente ranuras o pequeños orificios (pinhole).
Sus dimensiones van desde pequeñas, 10-20 µm a grandes, 50-100 µm
Cuanto mayor es la apertura, mayor es la señal Raman admitida hacia el espectrógrafo y mayor es la señal que aparece en el espectro.
Las aperturas menores (10-25µm) entregan la resolución espectral especificada para el instrumento. Usando una apertura mayor (10 – 25 µm) se degradará levemente la resolución espectral. Sin embargo, la pérdida de resolución espectral con frecuencia es insignificante. Una comparación rápida de espectros adquiridos con cada tamaño de apertura ayudará a la decisión. La elección de la apertura para la aplicación requiere algo de experimentación. La figura 1 muestra una tableta de acetaminophen medida con excitación de 532 nm. La diferencia en resolución espectral es mínima.
Las aperturas pinholes admiten la menor cantidad de luz.
Los pinholes se necesitan solo cuando se requieren operaciones confocales con el microscopio Raman.
La elección aquí es relativamente simple: si no se necesita operación confocal, se debe usar slits. Con una muestra grande, siempre usar slits dado que la capacidad confocal no es necesaria.
Tener presente cuando se comparan especificaciones de instrumentos es en el tamaño absoluto de la apertura. El tamaño depende del diseño óptico. Una apertura de 10µm en un diseño puede ser equivalente a una de 25 µm en otro.
El tamaño por si solo no dicta la resolución espectral.

FIGURA 1: Slit de 25 µm de apertura, espectro azul, comparado con espectro rojo con slit de 50µm de apertura

 

Cuando usar una apertura menor
A veces se requiere mayor resolución para identificar adecuadamente muestras. Por ejemplo, distinguir entre diferentes polimorfos u observar los modos de “respiración” de los anillos en nanotubos de carbono. El espectro Raman de l-Cystine (Figura 2) es un buen ejemplo para mostrar los beneficios de una elevada resolución espectral. l-Cystine se usa a veces para medir la resolución de un espectrómetro Raman debido a que posee varias bandas muy juntas. Por ejemplo, los dos picos a 76.8 y 65.7 cm-1. También hay una banda sobre el pico de 110 cm-1 que requiere alta resolución para ser detectada. Aunque, aun en este caso 3-4 cm-1 es suficiente. Lo más importante a recordar es que una apertura grande puede suministrar un espectro en casos donde la señal Raman es muy débil con una menor pérdida de resolución. Si hay una señal Raman adecuada, entonces siempre usar la menor apertura que entregue la mejor resolución espectral. A pesar de la percepción que cuanto mayor la resolución, mejor; de nuevo, hay un compromiso, los análisis Raman más prácticos incluyendo identificación, detección de desplazamiento de picos y la revelación de estructuras finas, pueden ser obtenidas con 4 y aun 8 cm-1 de resolución. Estas resoluciones proveen un balance ideal entre información analítica y relación señal/ruido (SNR).

FIGURA 2: Comparación de resolución espectral usando dos redes diferentes de alta y baja resolución.
Verde = 532 Red de amplio rango con apertura de slit de 50 µm
Púrpura = 532 Red de amplio rango con apertura de slit de 25 µm
Azul: = 532 Red de alta resolución con apertura de slit de 50 µm
Rojo = 532 Red de alta resolución con apertura de slit de 25 µm

 

Tiempo de exposición vs. número de exposiciones
Los instrumentos Raman modernos deberían permitir el control de la adquisición de datos ajustando ambos tiempo de exposición y número de exposiciones para un espectro final. Para mejorar los resultados se comienza por maximizar el tiempo de exposición; el tiempo de exposición es completamente análogo a una cámara fotográfica. Tal como una exposición mayor da una mejor foto con poca luz, se obtiene un mejor espectro de una pobre dispersión Raman.
La espectroscopia es estática. Como tal, para mediciones científicas, es práctica común registrar múltiples exposiciones y combinarlas.
Esto se ha hecho por años por astrónomos, físicos y químicos.

Dadas las dos opciones, mayores tiempos de exposición vs. más exposiciones, ¿cuál es mejor?
La decisión de elegir entre mayores tiempos de exposición o usar más exposiciones tiene que ver con la relación-señal-ruido. Las señales Raman son medidas en cuentas por segundo (cps). El uso de mayores tiempos de exposición o la promediación de muchos espectros no incrementará la señal

– solo reducirá el ruido. Los tópicos anteriores (potencia del láser y apertura) explican cómo aumentar la señal Raman. De modo que el asunto se reduce a qué hace un mejor trabajo en reducir el ruido en el espectro final. Resulta que las principales fuentes de ruido en los modernos sistemas Raman dispersivos, son los ruidos de lectura y “shot noise”. (1/f ruido). El ruido de lectura es el introducido cuando la carga en el CCD es digitalizada y convertida en un espectro. El shot noise es proporcional a la intensidad de la señal (ya sea Raman o fluorescencia) . La mayoría de los detectores CCD son muy “silenciosos” y no contribuyen significativamente al ruido cuando adquieren una señal durante la exposición. Para una muestra “silenciosa” con poco shot noise, tiene sentido, para un tiempo de medición dado, dos exposiciones prolongadas ya que producen menos ruido que muchas exposiciones cortas ya que se llevarán a cabo menos operaciones de lectura.

La figura 3 es un buen ejemplo que demuestra este efecto. La muestra usada para la figura 3, silicio con excitación de 532 nm, es adquirida para un tiempo total de medición de un minuto.

El número de exposiciones y el tiempo de exposición son variados para producir el mismo tiempo total de medición. El trazo superior (verde) es el menor tiempo de exposición (60 exposiciones por segundo); el trazo inferior (rojo) es el de mayor tiempo de exposición (2 exposiciones por segundo.) Está claro que el mayor tiempo de exposición entrega un ruido menor. Para muestras con un background( fondo) de fluorescencia la diferencia es menos pronunciada. La razón es que el shot noise generado por la señal de fluorescencia ahora contribuye más al nivel de ruido en el espectro que otras fuentes de ruido.

FIGURA 3: Silicio con láser de excitación de 532 nm. 60 exposiciones de 1 segundo (verde- superior) 30 exposiciones de 2 segundos (central -azul) y 2 exposiciones de 30 segundos (inferior-rojo).
Para muestras con mucha señal Raman, no hace una gran diferencia cual combinación de tiempos de exposición y número de exposici nes se seleccionen. Es en muestras que dispersan débilmente el Raman estas guías tienen realmente valor.

La figura 4 muestra un espectro Raman de azúcar usando un tiempo total de medición de 1 minuto y 532 nm de excitación. Un espectro muestra un tiempo de exposición prolongado (10 exposiciones de 6 segundos) el otro usa un gran número de exposiciones (60 exposiciones de 1 segundo) El inserto muestra un aumento de la línea de base desde 2600 cm-1 a 2300 cm-1 “Raman shift”. El espectro de 2 exposiciones de 30-seg muestra una leve reducción del ruido pero la diferencia es despreciable.

A través de estas discusiones se han usado 2 exposiciones. Es posible usar una exposición, pero es necesario considerar una importante fuente de interferencias para detectores integradores tales como los CCD: los rayos cósmicos. Recientemente, los sistemas Raman se han vuelto más “inteligentes” e incorporan muchas de las consideraciones vistas arriba en el software. Por ejemplo, los sistemas Raman de Thermo Scientific incluyen una auto-exposición patentada*.

La autoexposición selecciona el tiempo óptimo de exposición y la cantidad de exposiciones para la muestra. Se selecciona la relación-señal-ruido junto con el máximo tiempo de exposición. El software determina los parámetros de adquisición de datos que entreguen el mejor espectro sin saturar el detector. (*US Patent 7,605,918 B2)

FIGURA 4: Tableta de azúcar medida con microscopio Raman usando dos distintas adquisiciones de 1 minuto. Top (azul) es 60 exposiciones de 1segundo; abajo (rojo) es 2 exposiciones de 30 segundos. Debido a una leve fluorescencia en la línea de base, el shot noise domina al ruido de lectura. La diferencia en ruido de línea de base es menor. ruido rms = 1.32 cps para 60 x 1 seg. (azul) versus 0.89 para 2 x 30 seg (rojo).

 

Foco de la muestra
Ya sea que se esté usando un microscopio Raman o un accesorio de sampling convencional (no-microscopio), la muestra se debe colocar en el foco correcto.
Es crítico que el foco del láser de excitación coincida con la óptica de adquisición del Raman.
Existen algunas técnicas Raman tal como Spatially Offset Raman Spectroscopy (SORS), que descansan en un offset de estos pasos ópticos. Para el propósito de esta discusión se asume espectroscopia Raman tradicional. Los instrumentos más modernos manejan esto usando la geometría de sampling de 180 grados. Esto usa la misma óptica para excitar y para observar la muestra. Aun con este diseño, sigue siendo importante que el láser y el espectrógrafo estén alineados ópticamente al paso del haz.

Accesorios de Sampling
Cuando se usan láseres de longitud de onda visible (514, 532, 633 nm),el foco visual y el foco Raman están muy cerca de estar a la misma distancia del lente. Es suficientemente simple enfocar la muestra visualmente (ocular del microscopio o cámara CCD) y adquirir los datos. Cuando se usan longitudes de onda mayores (780 nm y mayor) existe una diferencia significativa entre el foco visual de la muestra y el foco que entrega la mejor señal Raman. Las longitudes de onda IR se enfocan más lejos del lente que las visuales. Después de enfocar visualmente en la muestra, es necesario “maximizar” la señal Raman. Lo mejor es hacerlo observando la señal Raman mientras se ajusta el foco, u, óptimamente usando Autofoco.

Autofoco ajusta la posición de la muestra para obtener la máxima señal Raman de la muestra. Para un microscopio Raman, la muestra debe ser puesta en la platina y enfocada visualmente en la muestra. Se requiere la opción de platina automatizada que incluye un motor para el foco en el eje Z.

Para sistemas Raman convencionales (no-microscopio) una capacidad autofoco es aún más útil debido a que no hay referencias visuales de foco. La muestra se coloca en el portamuestra y se arranca con la adquisición. El sistema ubicará la posición para la máxima señal Raman. Los algoritmos usados por un software como el Thermo Scientific OMNIC permiten la modificación del comportamiento del autofoco del sistema. La señal de background a veces interfiere con el autofoco, por ejemplo cuando se intenta medir una muestra en el fondo de una placa de pocillos de plástico. El material plástico también produce una señal Raman. Dependiendo de la intensidad de la señal Raman del analito, la señal del plástico puede “engañar” la operación del autofoco. Para eliminar este problema, Los sistemas Raman del tipo DXR proveen la opción de ignorar la interferencia del background. El software permite identificar un espectro de referencia y restarlo antes de efectuar la operación de autofoco.

Manejo del Background
La recomendación final involucra la corrección de background. Esto parece en realidad contradictorio debido a que Raman es un experimento de dispersión que, idealmente no tiene background. El “background” es en realidad la señal oscura del detector CCD. La señal oscura es el producto de la corriente oscura y del tiempo de exposición. Si alguno de los dos cambia, el background cambia. La corriente oscura incluye electrones residuales en el detector y depende principalmente de la temperatura. A medida que el CCD se enfría la corriente oscura disminuye (beneficio) pero la eficiencia cuántica EQ también se reduce negativamente. Es por eso que la mayoría de los sistemas Raman utilizan un detector enfriado (CCD). Si bien algunos detectores CCD son capaces de operar a temperaturas de nitrógeno líquido, ello no ofrece para Raman la ventaja de reducción de ruido dado que, efectivamente la eficiencia cuántica queda anulada a estas temperaturas tan frías. Una buena manera de corregir por esta señal de corriente oscura es almacenar un espectro de background medido a diferentes tiempos de exposición a la vez que se mantiene constante la temperatura del detector. Esto es un pequeño inconveniente porque cada vez que se cambia el tiempo de exposición se requiere de un nuevo background. Afortunadamente el software en los sistemas más modernos utiliza el cache de datos para manejar esto suavemente. Un software como OMNIC™ emplea una tecnología patentada* que mide el background a través del rango de tiempos de exposición. Se construye un modelo matemático que se usa para predecir la respuesta de background para cualquier tiempo de exposición. Esto permite que se utilice cualquier tiempo de exposición sin tener que adquirir un nuevo background.
(*US patent 7,471,390 B2).

Rechazo de Rayos Cósmicos
Los rayos cósmicos son eventos naturales detectados por detectores integradores sensibles como los CCD. Son eventos aleatorios e impredecibles. Típicamente se muestran como pulsos en los espectros Raman o de background. También pueden aparecer como amplias singularidades.

La mayoría de los sistemas proveen el rechazo a rayos cósmicos como una opción durante la adquisición de datos. Es una buena idea usar siempre esta opción, particularmente para exposiciones prolongadas, mayores que unos pocos segundos. Si bien los rayos cósmicos son infrecuentes, no es inusual adquirir uno en exposiciones de 30 – 60 segundos.

El rechazo de rayos cósmicos exige dos exposiciones. Las dos exposiciones son comparadas para detectar y reparar eventos. Es por esto que muchos sistemas requieren de dos exposiciones para cada adquisición. Aun si los rayos cósmicos no son detectados, la segunda exposición es ventajosa porque reduce el ruido promediando la señal. El rechazo de rayos cósmicos empleado por los instrumentos como los Raman de Thermo Scientific es patentado*, por su exclusiva habilidad de reconocer cambios espectrales que son debidos a otros fenómenos tales como fotoblanqueado y fluorescencia, y tratarlos apropiadamente. Esta tecnología provee un rechazo de rayos cósmicos sin precedente, pero el beneficio último es más datos correctos al primer intento.
(*US Patent 7,233,870 B1).

 

Fotoblanqueado (Photobleaching)
El fotoblanqueado expone a la muestra a radiación laser por un tiempo determinado antes de comenzar la adquisición de datos. Esta exposición al láser reduce la fluorescencia al “blanquear” impurezas en la muestra que ocasionan la fluorescencia.

La figura 5 es un ejemplo de los beneficios del fotoblanqueado.
La muestra es una tableta de Tylenol® medida con un excitación láser de 532 nm. La señal de background cae a la mitad de 12,000 cps a 6000 cps resultando en un incremento de 40% en la SNR debido a la reducción en shot noise.

 

FIGURA 5: Un espectro Raman antes (arriba, rojo) y después (abajo, azul) de fotoblanqueo. Tableta de Tylenol, láser de excitación de 532 nm.

Alineación y Calibración
Alineación y Calibración son dos tipos distintos de operaciones que garantizan la mejor performance del instrumento. La alineación es el proceso de llevar el foco del haz del láser de excitación y el punto de enfoque de la muestra en el espectrógrafo al mismo punto.
La calibración asegura la exactitud de la longitud de onda del espectro (eje X) y la intensidad (eje Y). La alineación implica ajustar la óptica del instrumento a una performance óptima. La calibración implica la medición de un estándar de referencia seguido por el procesamiento con algoritmos matemáticos.
Típicamente, ambas operaciones se hacen en la fábrica en los sistemas nuevos y verificados nuevamente cuando el sistema se instala en el laboratorio.

Alineación
La alineación es el proceso de llevar el foco del haz del láser de excitación y el punto de enfoque de la muestra en el espectrógrafo al mismo punto

• El recorrido del haz del láser – el punto del láser (spot) define el punto de sampling.
• El paso óptico del espectrógrafo define hacia dónde está mirando el espectrógrafo.

Para un microscopio Raman, hay una restricción adicional:
• El punto de sampling debe coincidir con un blanco (target) visual, tal como una retícula.
• El paso óptico visual define la retícula que indica dónde ubicar la muestra.

Para obtener una alineación óptima, se ajusta la óptica dentro del instrumento. Idealmente, esto debería ser una operación de rutina que no requiere una llamada al servicio técnico.

El proceso descripto abajo es un método para asegurar que los tres haces estén de acuerdo.

Para sistemas con microscopio, se coloca un accesorio de alineación sobre la platina y se enfoca sobre su orificio iluminado (pinhole) de modo que esté en la retícula del objetivo del microscopio.

La alineación del espectrógrafo ajusta el paso óptico del instrumento de modo que la señal del orificio (pinhole) esté maximizada. Esto garantiza que el foco del espectrógrafo coincide exactamente con la referencia visual (retícula).

En los sistemas Raman de Thermo Scientific, la operación de alineación usa una óptica y un algoritmo patentado* para encontrar automáticamente y guardar la posición óptima.

En este punto, el espectrógrafo y la referencia visual están alineados. El paso final es alinear el láser. La alineación del láser ajusta el láser de modo de maximizar la señal Raman. Esto garantiza que el foco del láser coincide exactamente con el foco del espectrógrafo. Esto se obtiene colocando la muestra Raman en el foco del objetivo del microscopio.
Nuevamente, la óptica es controlada por un algoritmo que automáticamente localiza y registra la alineación óptima.

La señal Raman del poliestireno es maximizada cuando ambos, el haz del láser y del espectrógrafo coinciden.
Un sistema bien alineado debería permitir seleccionar visualmente una muestra tan pequeña como 1 micrón, y adquirir un buen espectro Raman de dicha muestra al primer intento, sin ajustes o correcciones posteriores.
(*US Patents 6,661,509 B2 and 7,460,229 B2).

 

 

Calibración
Como se mencionó anteriormente, la calibración asegura la exactitud de la longitud de onda (eje-X) y de la intensidad (eje-Y). La calibración del eje-X usa material de referencia con posiciones conocidas de “Raman shift”, por ejemplo, neón para calibrar longitud de onda o poliestireno para calibrar para Raman shift (cm-1). La calibración del eje-Y intenta corregir funciones del instrumento de tal modo que las bandas Raman en el espectro tengan la misma intensidad relativa sin tener en cuenta el láser de excitación u otros componentes del sistema.

La corrección de intensidad utiliza una luz blanca estándar (de emitancia conocida) o un material de vidrio fluorescente; NIST tiene un programa de certificación para materiales de vidrio fluorescente.

En cuanto a alineación, la operación de calibración debiera ser una operación de rutina sin ningún tipo de complejidad. Generalmente implica colocar muestras de calibración (artefactos) en el punto de sampling y adquirir espectros de referencia. Desde de allí, el software calcula automáticamente los parámetros de calibración y los aplica a las subsecuentes adquisiciones de datos.

Conviene tener en cuenta que la calibración es dependiente de la alineación óptica del sistema. Por lo tanto, para las mejores prácticas el instrumento necesita ser re-calibrado después de haber cambiado la alineación. La estabilidad del instrumento depende de varios factores tales como ambientales, prácticas de laboratorio, etc. Probablemente el mejor consejo es mantener registros de una muestra estándar y dejarla que sea el indicador de cuando re-calibrar. La mayoría de los sistemas poseen software de validación o verificación que automatizan dicho proceso y proveen gráficos de tendencia mostrando la performance del equipo con el correr del tiempo. Los algoritmos de calibración incluyen métodos mono y multipuntos. Si se desea demostrar la exactitud de longitud de onda a través de un rango espectral, es altamente recomendable usar una calibración usando los picos que cubran dicho rango.

Conclusión
Los avances en el diseño y la tecnología de los instrumentos han hecho que el uso de un espectrómetro Raman sea más sencillo que nunca antes. En la mayoría de los casos se pueden obtener resultados excelentes sin la necesidad de manipular un número de parámetros operativos así como muchas cámara fotográficas modernas entregan resultados excelentes simplemente seteando a “Auto”; sin embargo, así como en las cámaras, se puede evitar los seteos automáticos y el propio usuario puede determinar los parámetros operativos. Por supuesto, una vez que se pasa a “Auto” se necesita adquirir conocimientos sobre la operación del espectrómetro.
Confiamos que esta nota ayude a ello.

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