Cuantificación de Taxol, sus degradantes y sustancias relacionadas mediante UHPLC con detección de aerosol cargado.
Autores:
Michael Menz y Frank Steiner Thermo Fisher Scientific, Germering, Alemania
Ian Acworth. Thermo Fisher Scientific, Chelmsford, MA, EE. UU.
Beneficios de la aplicación
- Respuesta uniforme en la elución en gradiente mediante la detección de aerosoles cargados con el flujo de trabajo de gradiente inverso Thermo Scientific™ Vanquish™ Flex Duo.
- Cuantificación de múltiples especies relacionadas con API por un solo calibrante
Objetivo
Primero, demostrar la capacidad de cuantificar múltiples impurezas con un solo calibrador mediante el uso de la respuesta uniforme inherente de la detección de aerosoles cargados (CAD). En segundo lugar, resaltar las capacidades del Sistema HPLC Thermo Scientific™ Vanquish™ Flex Duo para proporcionar compensación de gradiente inverso, que es esencial para lograr una cuantificación confiable de un solo calibrante con CAD.
Introducción
Según la Organización Mundial de la Salud, el cáncer es la segunda causa de muerte en todo el mundo y fue responsable de 8,8 millones de muertes en 2015. En todo el mundo, casi 1 de cada 6 muertes se debe al cáncer. Existe un interés considerable en el desarrollo de medicamentos innovadores para apoyar terapias (p. ej., quimioterapia) o para tratar a los pacientes individualmente con medicamentos de última generación.
Un ejemplo es el fármaco conocido bajo su nombre comercial Taxol®, que pertenece a la familia de los taxanos y puede extraerse directamente de la corteza del tejo del Pacífico (Taxus brevifolia ) u obtenerse por síntesis química parcial a partir de un precursor.
Para cualquier sustancia farmacéutica, las impurezas no deseadas son una preocupación clave durante el desarrollo de fármacos y durante todo el ciclo de vida de un producto farmacéutico. El control de estas impurezas, que a menudo están presentes en escasa cantidad en comparación con el ingrediente farmacéutico activo (API), es obligatorio para garantizar un producto seguro y eficaz. Aunque algunas impurezas pueden estar estrechamente relacionadas con el API, es probable que no haya estándares de calibración disponibles, especialmente durante las primeras etapas de desarrollo. Por lo general, el (U)HPLC con detección UV/Vis es la opción preferida para el análisis, pero las sustancias que carecen de un cromóforo o que varían mucho en sus factores de respuesta, es decir, sus coeficientes de extinción son difíciles de analizar. Los problemas con la detección UV/Vis también se aplican al control de contraiones y especialmente a los estudios de estabilidad y degradación, que son necesarios para apoyar el desarrollo del producto. Como consecuencia, a menudo es difícil cumplir con los requisitos analíticos para demostrar la calidad del producto. Las incertidumbres en la cuantificación dificultan la clasificación precisa de las impurezas de acuerdo con las pautas de la ICH con respecto al umbral de notificación, identificación o calificación, que existen para prevenir efectos secundarios graves de la formulación final del fármaco.
CAD se puede utilizar para superar estos desafíos de cuantificación (por ejemplo, problemas de respuesta o detectabilidad). Dado que la respuesta de CAD es independiente de la estructura química de los analitos no volátiles, es un enfoque cromatográfico ideal cuando no se dispone de calibradores individuales.
En condiciones isocráticas, la curva de calibración obtenida con CAD usando un estándar disponible, por ejemplo, el estándar de referencia de un API, puede usarse para cuantificar todos los analitos no volátiles en una muestra, dentro de un cierto rango de confianza. Dado que la respuesta de CAD se ve afectada por la composición de la fase móvil, es necesario asegurarse de que la respuesta universal sea aplicable en la elución en gradiente. Esto se puede lograr fácilmente a través de un gradiente de compensación proporcionado por la Bomba dual Thermo Scientific™ Vanquish™ Flex.
En esta nota de aplicación, se utilizó una columna de pentafluorofenilo (PFP) Thermo Scientific™ Accucore™ para separar el fármaco de sus compuestos relacionados y otras impurezas. Se utilizó la calibración utilizando estándares de el fármaco y compuestos relacionados para estimar las cantidades de impurezas desconocidas presentes en el producto. También se realizó un estudio de degradación térmica analizando los productos de degradación y posteriormente cuantificando mediante UHPLC-UV- CAD.
Experimental
Consumibles y equipos de laboratorio recomendados
- Columna de pentafluorofenilo (PFP) Accucore, 2,6 µm,
- 2,1 × 150 mm, L43 (N/P 17426-152130)
- Fisher Scientific™Acetonitrilo de grado LC-MS (P/ N A955-212)
- Thermo Scientific™ Sistema de purificación de agua ultrapura Barnstead™ GenPure™ xCAD Plus (N/P 50136171)
- Thermo Scientific™ Baño seco con agitación y calentamiento digital (N/P 88880028)
Preparación de la muestra
Calibración
El API y las impurezas relacionadas C (Impureza C) y A (cefalomanina) se compraron de la Farmacopea Europea (Estrasburgo, Francia) y de los Estados Unidos (Rockville, MD, Estados Unidos), respectivamente. Baccatin III (pureza 97%) se obtuvo de Sigma-Aldrich®(Schnelldorf, Alemania) y solo se usó para la identificación de picos. Todos los estándares de calibración se pesaron con precisión y se transfirieron a matraces volumétricos y se enrasaron con metanol para lograr una concentración final de 0,1 mg/mL. Se preparó una solución madre de 10 µg/mL que contenía las tres sustancias transfiriendo cada una de ellas a un matraz volumétrico y llevando al volumen con metanol. En consecuencia, los estándares de calibración de 10, 5, 1 y 0,5 µg/mL se produjeron mediante una serie de diluciones con metanol y cada uno se analizó en tres corridas consecutivas con inyecciones en blanco entre las diferentes concentraciones. Debido a la limitada estabilidad en solución, los estándares se prepararon directamente antes del análisis.
Degradación forzada
Para el estudio de degradación térmica, se diluyó un volumen de 100 µl de una solución del fármaco de 1 mg/ml con 350 µl de metanol y 50 µl de dimetilsulfóxido (DMSO) en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. La solución se expuso a 65 °C durante 2 horas utilizando un baño seco con agitación y calentamiento digital. A continuación, la muestra degradada se analizó inmediatamente sin más preparación de la muestra.
Instrumentación
La separación se logró utilizando una columna Accucore PFP, que es muy adecuada para la separación de compuestos aromáticos. Las condiciones cromatográficas se resumen en la Tabla 1. La detección se realizó con el detector de longitud de onda variable Thermo Scientific™ Vanquish™ Flex seguido del detector de aerosol cargado Thermo Scientific™ Vanquish™ Flex.
El sistema UHPLC Vanquish Flex Duo para Inverse Gradient constaba de:
- Base del sistema Vanquish Flex (P/N VF-S01-A-02)
- Bomba doble F (P/N VF-P32-A-01)
- Split Sampler FT (P/N VF-A10-A-02) con un loop de muestra de 25 µL
- Compartimento de columna H (P/N VH-C10-A-02)
- Detector de aerosol cargado F (P/N VF-D20-A)
- Detector de longitud de onda variable F (P/N VF-D40-A)
- Vanquish Duo para kit de gradiente inverso (P/N 6036.2010)
Esquema fluídico
La figura 1 ilustra la configuración del flujo de trabajo de gradiente inverso de Vanquish Duo. La parte derecha de la bomba de gradiente dual entrega el flujo de eluyente a la columna (gradiente analítico), y la bomba izquierda forma el segundo gradiente (gradiente de compensación) directamente a la pieza en T inmediatamente antes del CAD.
Condiciones de separación
Procesamiento de datos
Se utilizó el sistema de datos cromatográficos (CDS) Thermo Scientific™ Chromeleon™, versión 7.2.8 para la adquisición y evaluación de datos.
Resultados y discusión
Calibración global
Como se mencionó anteriormente, la respuesta uniforme del detector de aerosol cargado se puede lograr de forma rutinaria en condiciones de nebulización isocrática. La nebulización se ve afectada por la composición del disolvente, por lo que un cambio en el contenido de disolvente orgánico durante un gradiente provocará un cambio en la respuesta del detector. Para compensar este efecto, se aplica un gradiente inverso después de la columna utilizando la bomba doble Vanquish Flex para proporcionar una composición de fase móvil uniforme. El gradiente inverso pasa por alto la columna y refleja la composición del gradiente analítico para lograr un flujo isocrático al nebulizador. La diferencia en la respuesta en UV y CAD utilizando el flujo de trabajo de gradiente inverso de Vanquish Duo se muestra en la Figura 2 (derecha). Esto muestra que la respuesta UV para 10 µg/mL de tres analitos diferentes difería hasta en un 63 %, mientras que la de CAD difería solo en un 2 %. Esto ilustra una vez más que la respuesta de CAD es independiente de la estructura química y la variación de la respuesta debido a los gradientes de solvente es mínima cuando se utiliza la bomba doble Vanquish Flex para realizar la compensación de gradiente inverso.
La calibración CAD es lineal para los tres compuestos en el rango de concentración de 0,5 a 10 ppm (Figura 2, izquierda). La respuesta uniforme para el API y los compuestos relacionados se demuestra por la gran similitud de las pendientes de las curvas de calibración y, por lo tanto, el flujo de trabajo es aplicable a la medición de impurezas relacionadas. Además, las pendientes de las curvas de calibración muestran una desviación relativa de la respuesta media de tan solo un 2%.
Análisis de productos de degradación API
Efecto de la compensación de gradiente inverso
La muestra API estresada se analizó utilizando el gradiente inverso Vanquish Duo con la bomba doble Vanquish Flex y se comparó con la misma configuración del sistema sin compensación de gradiente (Figura 3). Ambas configuraciones pueden detectar el mismo número de picos, pero se nota una diferencia significativa en la respuesta de los picos.
Para la muestra estresada que se muestra en la Figura 3, se encontró que las áreas de los picos combinados para todas las impurezas con CAD eran el 63,9 % del área del pico del API cuando no se usaba la compensación de gradiente inverso (trazo azul) y el 53,8 % del API cuando se usaba la compensación de gradiente inverso (traza roja). Esta gran diferencia (>10 %) en el contenido de impurezas determinado se atribuye a la influencia de la composición del solvente en la respuesta de CAD. Como era de esperar en los gradientes de fase inversa, los factores de respuesta para los picos de elución posteriores son mayores cuando no se utiliza la compensación de gradiente inverso (consulte el recuadro de la Figura 3). Estos datos destacan las capacidades del flujo de trabajo de gradiente inverso Vanquish Duo para lograr una respuesta uniforme con CAD y, por lo tanto, minimizar los errores de cuantificación.
Comparación entre UV y CAD
La combinación de detección de absorbancia ultravioleta y aerosol cargado puede proporcionar un enfoque más holístico al analizar muestras complejas. Como se muestra en la Figura 4, algunos picos carecen de actividad UV y, por lo tanto, no se puede medir utilizando UV de longitud de onda única a 227 nm. Uno de los productos de degradación que eluye a los 6,6 minutos solo es visible mediante detección UV, ya que es demasiado volátil para ser detectado por CAD. Las dos impurezas principales (24,3 y 27,1 min) solo son detectables en CAD.
El análisis exhaustivo de los productos de degradación de nuevos fármacos es factible utilizando el enfoque de detectores múltiples con UV y CAD. Ahora se puede cuantificar un producto de degradación de ejemplo (pico en el minuto 9,8) con un comportamiento de retención similar al del precursor bacatin III mediante la calibración global (Figura 2). Aquí, el compuesto de ejemplo tiene un área relativa con respecto al API de 1,1%. La desviación estándar relativa (n=5) de la precisión del área del pico es 0,25 % para el pico que eluye en el minuto 9,8 y 0,76 % para el API. El sistema de gradiente inverso Vanquish Duo, que utiliza CAD y UV, es una herramienta extremadamente poderosa debido a la naturaleza complementaria de los dos detectores y es muy adecuado para estudios de estabilidad o degradación.
Conclusión
La respuesta uniforme para el análisis de degradación con detección de aerosoles cargados se puede lograr fácilmente con un flujo de trabajo de UHPLC Vanquish Duo y una columna de gradiente inverso posanalítica. El flujo de gradiente inverso y analítico combinado produce una composición de eluyente constante en el nebulizador CAD, lo que da como resultado una respuesta uniforme incluso durante las ejecuciones de gradiente. La prueba de concepto se presenta aquí utilizando el fármaco contra el cáncer y dos impurezas relacionadas, que mostraron una variación en la pendiente de calibración de solo el 2 %. Además, el flujo de trabajo de gradiente inverso se aplicó con éxito al análisis de impurezas de un estándar del fármaco, lo que resultó en una respuesta del analito medible más uniforme en todo el gradiente.
Con el gradiente inverso de Vanquish Duo, las cantidades medidas de analitos se corrigieron en más del 10 %, lo que proporcionó una determinación más precisa e imparcial de las impurezas críticas.
Cuando se combina con la detección UV, el perfil integral resultante de un nuevo candidato a fármaco, sus impurezas, degradantes y sustancias relacionadas es sencillo, lo que convierte a esta configuración de detectores múltiples en una herramienta poderosa para los laboratorios analíticos.
Referencias
- http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/; accedido20/11/2017
- http://www.ich.org/products/guidelines; consultado el 20/11/2017
- Paul Gamache, Detección de aerosoles cargados para cromatografía líquida y técnicas de separación relacionadas, Wiley-VCH, mayo de 2017.
- Folleto de detección de aerosoles cargados;https://tools.thermofisher.com/content/sfs/ brochures/D22519.pdf; consultado el 20/11/2017
- Nota técnica de Thermo Scientific: Detección de aerosol cargado (CAD): factores que afectan la respuesta uniforme del analito; en prensa.
Solo para uso de investigación. No debe utilizarse en los procedimientos de diagnóstico.
Obtenga más información en thermofisher.com/VanquishDuo
