Muestreo de virus patógenos humanos del aire mediante filtros de membrana de gelatina y detección posterior mediante análisis por PCR

 

Claudia Scherwing¹, Dra. Diana Patzelt¹
Desarrollo de Productos Esenciales de Laboratorio, Sartorius Stedim Biotech, Göttingen, Germany

* Correspondencia
E-Mail: claudia.scherwing@sartorius-stedim.com

 

 

1. Introducción

Los brotes de enfermedades infecciosas representan un importante problema de salud pública mundial, pero también plantean desafíos y amenazas de gran alcance para las economías y los sistemas de salud mundiales. Las infecciones virales sin tratamientos antivirales son particularmente amenazantes, por lo tanto, comprender las fuentes de infección y las vías de transmisión y cómo contribuyen a la propagación de la enfermedad puede facilitar la prevención efectiva y la adopción de medidas de control.

Actualmente, la pandemia de COVID-19 demuestra la importancia de los conocimientos sobre la transmisión, así como la infectividad de los virus patógenos humanos en el tiempo y el espacio.

Además de la inhalación de gotitas de líquido, el contacto cercano con personas infectadas o el contacto con superficies contaminadas, la transmisión de virus en aerosol es un aspecto importante a considerar.^{1, 4, 5, 8, 9-11}.

En la actualidad, hay poca información sobre las características de los aerosoles que contienen SARS-CoV-2 en el aire, su concentración, patrones y comportamiento durante la transmisión en el aire debido a las dificultades para tomar muestras de aerosoles cargados de virus y los desafíos en su cuantificación a baja concentración. Tal falta de comprensión limita la evaluación efectiva del riesgo, la prevención y el control de los brotes de la enfermedad COVID-19⁸.

Sin embargo, ya hay varios estudios centrados en este aspecto, sobre la importancia del aire como ruta de transmisión para los virus.^{1 7, 8}.

Los resultados de estos estudios indican una cierta estabilidad de los virus en el aire dependiendo de la especie y enfatizan la importancia de monitorear el aire para la detección fuentes potenciales de infección, así como la identificación de las formas de transmisión¹.

Además, debe observarse la medida de cuarentena, así como deben observarse procedimientos de limpieza y desinfección⁸ como por ejemplo, aquellos realizados después de los brotes de norovirus.

Van Doremalen 2020 señaló que los virus patógenos muestran una presencia ambiental prolongada que persiste como aerosoles durante varias horas. La persistencia del genoma del virus podría detectarse incluso más de 24 h después de la liberación.^{9, 11}. También puede ocurrir el transporte aéreo a larga distancia de virus patógenos³. Por lo tanto, el desarrollo y la mejora de diferentes métodos para la detección cuantitativa de virus en muestras de aire es importante⁴.

Aunque, actualmente, no existen hay oficiales para monitorear virus en el aire de manera regular, varios científicos que se centran en este tema defienden firmemente la necesidad de controlar el aire durante los brotes¹.

 

Fig. 1: Air sampling set-up using gelatin filter disposables with either MD8 Airscan or the portable AirPort MD8.

 

2. Filtros de membrana de gelatina para tomar muestras de virus del aire

El método de filtro de gelatina es un método fácil, altamente eficiente y sensible para el monitoreo de microorganismos patógenos en el aire, así como de virus^{1, 2, 4, 6, 8}.

La idoneidad de los filtros de gelatina solubles en agua, especialmente para el muestreo de virus, ya ha sido probada y comprobada^{1, 4, 6, 7, 8, 10, 11}.

Los filtros son particularmente adecuados ya que muestran una excelente eficiencia de recolección de virus con tasas de retención de hasta 99.76%^{2, 6}.

Además, el procedimiento de muestreo de aire con filtros de gelatina permite varias posibilidades para extender la parte inferior del límite de detección de hasta 102 partículas / m^3,6. Ofrece la opción de prolongar el período de muestreo (muestreo de altos volúmenes de aire, como 2000 l), un área de filtración de hasta 50 cm² (Ø 80 mm), un caudal de hasta 50 l / min y la reducción del volumen de disolvente a un mínimo de 80 – 100 µl / cm² de área por filtro^{4, 6, 8}.

También están disponibles tamaños de filtro más pequeños como Ø 47 mm (area de filtración 17 cm²) por lo tanto, el volumen de disolvente puede reducirse aún más a tan solo 1,5-2,0 ml.

Se ha demostrado la alta competitividad de los filtros de gelatina por Jaschhof (1992a, 1992b) y Friese, quien observó que en casos individuales, el filtro de gelatina es superior a otros métodos de muestreo de virus.

Esta eficiencia se logra sin realizar ningún paso adicional preparatorio o posterior al procesamiento para tomar muestras de virus en aerosoles, mientras se mantiene la capacidad de retención constante del filtro⁶.

Los filtros de gelatina están disponibles premontados y preesterilizados en las unidades de filtración listas para usar.

Junto con el equipo ligero y portátil MD8 AirPort®, la filtración de gelatina es un método que es especialmente adecuado para aplicaciones móviles y proporciona una facilidad de uso^{4, 6}.

Más allá de eso, Jaschhof (1992b) demostró que la duración del muestreo y una humedad relativa de hasta 80 – 85% a 30 ° C no afectaron negativamente la retención de virus, que resultó ser del 99,76% en promedio.

Otro beneficio es que durante el muestreo de virus patógenos humanos no se necesita líquido, lo que reduce el riesgo de infección del personal durante las pruebas analíticas.

La reducción reportada de la capacidad de infección del virus después del muestreo¹ con filtros de gelatina^{1, 4} demuestra ser ventajosa ya que las muestras pueden considerarse como material no infeccioso.

Además, la posibilidad de almacenar los filtros de gelatina después del muestreo¹, así como la posibilidad de enviar los filtros de gelatina a otro laboratorio para un análisis posterior antes de la disolución, puede ser muy beneficioso.

 

3. Procesamiento de filtros de membrana de gelatina para la detección de virus por análisis de PCR

Tan pronto como el filtro de gelatina se haya disuelto en agua desionizada o cualquier otro tampón o medio apropiado, todas los virus y las partículas retenidas en el filtro pueden procesarse y ser detectados usando PCR^{4, 8, 10, 11}.

Para obtener resultados rápidos, sensibles, altamente específicos y confiables sobre la presencia de virus específicos cuantitativamente el PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR) es el método de elección^{1, 2, 4, 8}.

Incluso material de ARN sensible puede ser detectado en la filtración en membranas de gelatina y qPCR^{1, 4, 8, 11}.

Sin embargo, debe considerarse que la extracción de ARN es un paso crucial en la preparación de la muestra. Por lo tanto, para reducir la pérdida de material genético, se debe prestar especial atención a este paso^{2, 4}.

Varios estudios mostraron que un análisis de PCR posterior al muestreo de aire con filtros de gelatina proporciona resultados de recuperación superiores a otros métodos de detección y, por lo tanto, puede ser considerado como un método preciso y práctico para la detección de virus en el aire^{4, 7}.

 

4. Procedimiento típico de muestreo de aire utilizando filtros de membrana de gelatina y preparación de muestras posteriores para la detección de virus en el aire por PCR

1) Desembale el filtros de gelatina desechable de 80 mm de Ø (ref-nº. 17528–80 ACD)

2) Monte la gelatina desechable en el portafiltros del quipo Sartorius MD8 (ya sea MD8 AirPort (ref-nº. 16757) o MD8 Airscan (ref-nº.16748))

3) Debe evitarse la contaminación del filtro al tocarlo.

4) Comience a tomar muestras de aire a una velocidad de p.ej. 50 l / min por 20 min (1000 l es un volumen de muestreo de aire típico)

5) Después del muestreo, separe el portafiltro junto con el desechable del MD8 girándolo en sentido contrario a las agujas del reloj.

6) La parte superior del portafiltros se separa de la base girándola en sentido contrario a las agujas del reloj.

7) Inserte el filtro de Ø 80 mm en un tubo falcon de 15 ml, -el filtro puede romperse fácilmente-,

8) El período de almacenamiento es opcional y ó el envío al laboratorio analítico.

9) Agregue 4 – 5 ml de solvente (por ejemplo, agua desionizada estéril o apropiado medio tampón)

10) Gire a 3000 x g en centrífuga.

11) Incubar en un agitador térmico (120 rpm) o calentar durante 10 minutos a 37°C para disolver la gelatina.

12) La inactivación de virus es opcional.

13) Siga la extracción de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

14) Disolver ARN.

15) Adición opcional de inhibidor de RNAsa

16) Procesar inmediatamente en hielo o período de almacenamiento opcional a -80°C.

17) Sintetizar ADNc por transcripción inversa utilizando un kit comercialmente disponible con primer y prime oligo dT en un termociclador.

18) Almacenamiento opcional de ADNc a -20°C.

18) Realizar análisis PCR (por ejemplo qPCR)

 

 

5. Áreas de aplicación para la detección de virus patógenos humanos en el aire

 

Monitoreo de la efectividad del procedimiento de limpieza y desinfección

Monitoreo de la transmisión de virus en aerosol en diferentes áreas hospitalarias, tales como:

• Áreas de pacientes.
• Áreas del personal sanitario (especialmente vestuarios)
• Áreas públicas
• Areas de deposición
• Ventilación de las habitaciones
• Servicios de pacientes

 

Supervisión de medios de transportes públicos tales como:

• Aviones
• Trenes, metro y tranvía
• Cruceros
• Ferris

Monitoreo de áreas públicas con alto tráfico de visitantes, tales como:

• Aeropuertos
• Estaciones de trenes, autobuses e intercambiadores

 

Identificación y monitoreo de posibles fuentes de infección, formas de transmisión o puntos calientes, tales como:

• Reuniones de personas
• Centros comerciales

 

6. Características clave de los filtros de membrana de gelatina para muestreo de virus y detección posterior por qPCR

• Alta eficiencia de muestreo (retención de hasta el 99,9% de partículas de virus)
• Muestreo de grandes volúmenes de aire posibles (tasa de flujo ajustable, diámetro de filtro de hasta Ø 80 mm), proporcionando así máxima sensibilidad.
• Retención efectiva en condiciones ambientales hasta 30 °C y 80 – 85% de humedad relativa.
• Soluble en pequeños volúmenes de líquido (mínimo 80 – 100 µl / cm² de área de filtro), proporcionando así una alta sensibilidad.
• Altas tasas de recuperación de ácidos nucleicos.
• No se necesitan líquidos para el muestreo.
• Reducción de la capacidad de infección de virus patógenos humanos.
• Almacenable después del muestreo.
• Envío en seco después del muestreo sin pérdida de recuperación.
• Los filtros de gelatina disuelta pueden procesarse aún más con métodos de prueba rápidos como qPCR
• Excelente facilidad de uso.

 

 

Referencias

1. Azhar EI, Hashem AM, El-Kafrawy SA, Sohrab SS, Aburizaiza AS, Farraj SA, Hassan AM, Al-Saeed MS, Jamjoom GA, Madani TA. 2014. Detection of the Middle East respiratory syndrome coronavirus genome in an air sample originating from a camel barn owned by an infected patient. mBio 5(4).
2. Burton NC, Grinshpun SA, Reponen T. 2007. Physicalcollection efficiency of filter materials for bacteria and viruses. Ann Occup Hyg. 51(2):143-51.
3. Dee S, Otake S, Oliveira S, & Deen J. 2009. Evidence of long distance airborne transport of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and Mycoplasmahyopneumoniae. Veterinary research, 40(4), 39.
4. Friese A. 2010. Aerogene Ausbreitung von Viren: Eine Studie verschiedener Sammelgeräte und Quantifizierungsmethoden zur Virusisolierung aus derLuft. Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) am Institut fürTierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen derVeterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig.
5. Ijaz MK, Karim YG, Sattar SA, Johnson-Lussenburg CM. 1987. Development of methods to study the survival of airborne viruses. Department of Microbiology andImmunology, School of Medicine, University of Ottawa.
6. Jaschhof H. 1992a. Sampling virus aerosols–comparativestudies on the efficiency of gelatin membrane filters, impaction collectors and impingers. Bio Tec; 4 (English translation).
7. Jaschhof H. 1992b. Sampling virus aerosols using thegelatin membrane filter—collection using a membrane filter at a high sampling rate. Bio Tec; 6 (English translation).
8. Liu Y, Ning Z, Chen Y, et al. 2020. Aerodynamic characteristics and RNA concentration of SARS-CoV-2 aerosol in Wuhan hospitals during COVID-19 outbreak. BioRxiv.
9. Van Doremalen N, Bushmaker T, Munster VJ. 2013. Stability of Middle East respiratory syndromecoronavirus (MERS-CoV) under different environmental conditions. Euro Surveill. 18(38).
10. van Doremalen N, Bushmaker T, Morris DH, et al. 2020. Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 asCompared with SARS-CoV-1. N Engl J Med.
11. Walenda T. 2007. Transmission von Viren über raum-lufttechnische Anlagen. Diplomarbeit am Institut fürLaboratoriums- und Transfusionsmedizin Herz- undDiabeteszentrum Nordrhein-Westfalen Universitäts-klinik der Ruhr-Universität Bochum in Bad Oeynhausen.

 

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