Dispersión de luz dinámica: definición de términos comunes

Existen varias fuentes de información que ofrecen una descripción matemática de los términos utilizados en dispersión de luz. Sin embargo, no siempre resultan útiles para comprender su uso en la aplicación práctica de la técnica. La lista de términos que se indica a continuación brinda una definición descriptiva sobre su uso específico en el contexto de la dispersión de luz dinámica.

Tamaño promedio z

El tamaño promedio z empleado en dispersión de luz dinámica es un parámetro también conocido como media cumulante. Se trata del parámetro principal y más estable generado por la técnica. El promedio z constituye el mejor valor que se puede informar en un entorno de control de calidad, dado que se encuentra definido en la norma ISO 13321 y, más recientemente, en la norma ISO 22412, que define esta media como el “diámetro de partícula armónico ponderado por intensidad”.

El tamaño promedio z solo se compara con el tamaño que se mide utilizando otras técnicas si la muestra es monomodal (es decir, presenta un solo pico), de forma esférica o casi esférica, monodispersa (es decir, estrecha amplitud de distribución), y se prepara en un disperante apto, dado que el tamaño promedio z puede ser sensible a los pequeños cambios de la muestra, es decir, la presencia de una pequeña proporción de agregados. Es importante advertir que el promedio z es un parámetro hidrodinámico y, por lo tanto, solo se aplica a partículas que se encuentran en dispersión o a moléculas en solución.

Análisis de cumulantes

Se trata de un método simple que analiza la función de autocorrelación generada por el ensayo DLS. El cálculo está definido en las normas ISO 13321 y 22412. Dado que consiste en la generación de momentos, puede producir una serie de valores. Sin embargo, solo los dos primeros términos se emplean en la práctica, a saber: el valor medio del tamaño (promedio z), y el parámetro de amplitud conocido como índice de polidispersidad (PdI). El promedio z es un valor calculado en base a la intensidad, que no debe confundirse ni compararse directamente con la media de masa o media de número derivada de otros métodos. El cálculo está definido en las normas ISO, por lo que todos los sistemas que utilizan este cálculo conforme se recomienda deberían arrojar resultados comparables si se utiliza el mismo ángulo de dispersión.

Índice de polidispersidad

Este índice consiste en un número que se calcula a partir de 2 parámetros que se ajustan a los datos de correlación (análisis de cumulantes). El índice de polidispersidad es adimensional, y se escala de tal modo que los valores inferiores a 0,05 rara vez se observan, excepto con patrones altamente monodispersos. Los valores mayores a 0,7 indican que la muestra posee una distribución muy amplia, y probablemente no sea apta para la técnica de dispersión de luz dinámica (DLS). Los algoritmos para los distintos tamaños de distribución operan con datos que se encuentran entre estos dos extremos. El documento de las normas ISO 13321:1996E y 22412:2008 define los cálculos para estos parámetros.

Polidispersidad

En dispersión de luz, los términos polidispersidad y % de polidispersidad provienen del índice de polidispersidad, un parámetro que se calcula a partir del análisis de cumulantes de la función de autocorrelación de intensidad medida por DLS. El análisis de cumulantes presupone un único tamaño de partícula, se aplica un único ajuste exponencial a la función de autocorrelación, y la polidispersidad describe la amplitud de la distribución gausiana presumible. Por ejemplo, en un análisis de proteínas, un porcentaje de polidispersidad menor a 20 indica que la muestra es monodispersa.

Coeficiente de difusión

Las partículas y moléculas en suspensión/solución experimentan el movimiento browniano. Se trata del movimiento inducido por el bombardeo que producen las moléculas en disolvente que se mueven a causa de su energía térmica. Si se utiliza láser para iluminar las partículas y moléculas, la intensidad de la luz dispersa fluctúa a una velocidad que depende del tamaño de las partículas, dado que las moléculas en disolvente empujan las partículas más pequeñas más lejos y se mueven más rápido. El análisis de dichas fluctuaciones de intensidad arroja la velocidad del movimiento browniano, y así, el tamaño de partícula mediante la relación Stokes-Einstein. Por lo tanto, el coeficiente de difusión define a este movimiento browniano del analito o partícula dentro del entorno específico del disolvente. El coeficiente de difusión traslacional no solo dependerá del tamaño del núcleo de la partícula sino también de cualquier estructura de superficie, y de la concentración y tipo de iones que se encuentren en el medio.

Diámetro hidrodinámico

El tamaño hidrodinámico medido por dispersión de luz dinámica (DLS) se define como “el tamaño de una esfera rígida hipotética que se disemina del mismo modo que la partícula que se mide”. Sin embargo, en la práctica, las partículas o macromoléculas en solución no son esféricas, dinámicas (circulantes), y solvatadas. Debido a esto, el diámetro calculado a partir de las propiedades difusionales de la partícula indica el tamaño real de la partícula dinámica hidratada y solvatada. De ahí la terminología “diámetro hidrodinámico”. Por lo tanto, el diámetro hidrodinámico o de Stokes, es el diámetro de una esfera que posee el mismo coeficiente de difusión traslacional que el de la partícula que se mide, suponiendo una capa de hidratación que rodea la partícula o molécula.

Curva de correlación o función de correlación

Los datos que se miden en un experimento de dispersión de luz dinámica (DLS) representan la curva de correlación, que debe ser una función exponencial de descomposición única y gradual para una dispersión de partículas de tamaño único. La curva de correlación contiene toda la información referente a la difusión de las partículas dentro de la muestra que se mide. Al ajustar la curva de correlación con la función exponencial, se puede calcular el coeficiente de difusión (D). “D” es proporcional a la vida útil de la descomposición exponencial. Al conocer el coeficiente de difusión (D), es posible calcular el diámetro hidrodinámico, utilizando una variación de la ecuación Stokes Einstein. Para una muestra polidispersa, esta curva es la suma de las descomposiciones exponenciales.

Intersepta Y o Intersepta

En DLS, la intercepta Y, o simplemente intercepta, hace referencia a la intersección de la curva de correlación sobre el eje y del correlograma. La intercepta Y resulta útil para evaluar la relación señal-ruido de una muestra analizada y, por lo tanto, se la utiliza a menudo para examinar la calidad de los datos. Por lo general, la intercepta se escala de modo tal que una señal ideal arroje un valor de 1, y un buen sistema genera interceptas superiores a 0,6, y mayores a 0,9 en los mejores sistemas.

Deconvolución o algoritmo de deconvolución

Se trata de un abordaje basado en un algoritmo que se utiliza para resolver una combinación de exponenciales derivadas de una muestra polidispersa y convertirla en una serie de valores de intensidad asociados a una banda de tamaño discreto. La distribución del tamaño de partícula en dispersión de luz dinámica (DLS) deriva de una deconvolución de la función de autocorrelación de intensidad medida de la muestra. En general, esto se logra utilizando el algoritmo de mínimos cuadrados no negativos (NNLS), siendo CONTIN el método más conocido.

Tasa de conteo o tasa de conteo de fotones

En DLS, la tasa de conteo de fotones hace referencia al número de fotones detectados, que generalmente se expresa “por segundo”. Resulta útil para determinar la calidad de la muestra, controlando su estabilidad como función de tiempo, y también se la utiliza para establecer parámetros de instrumentos, como la configuración del atenuador y, a veces, la duración del análisis. La tasa de conteo debe presentar un valor superior al mínimo a fin de tener suficiente señal para el análisis. Sin embargo, todos los detectores poseen una tasa de conteo máxima en la que la respuesta permanece lineal y, si la tasa de conteo no se ajusta automáticamente, se deben seguir las recomendaciones del fabricante para dicho fin.

Distribución de la intensidad

El resultado de primer orden de un experimento DLS es la distribución de la intensidad del tamaño de partícula. La distribución de la intensidad se pondera de acuerdo con la intensidad de la dispersión de cada fracción o familia de partículas. Para los materiales biológicos o polímeros, la intensidad de la dispersión de partículas es proporcional al cuadrado del peso molecular. Como tal, la distribución de la intensidad puede ser un tanto engañosa, dado que una pequeña cantidad de agregación/aglomeración o presencia de partículas más grandes puede dominar la distribución. Sin embargo, esta distribución puede utilizarse como detector sensible de presencia de material de gran tamaño en la muestra.

Distribución de volumen

A pesar de que la distribución del tamaño fundamental generada por DLS es una distribución de intensidad, esto puede convertirse, mediante la teoría de Mie, a una distribución de volumen o una distribución que describa la proporción relativa de múltiples componentes en la muestra basado en su masa o volumen en lugar de su dispersión (intensidad).

Al convertir la distribución de intensidad a distribución de volumen/masa, es importante aceptar 4 supuestos.

• Todas las partículas son esféricas.
• Todas las partículas son homogéneas.
• Las propiedades ópticas de las partículas se conocen, es decir, los componentes reales e imaginarios del índice de refracción.
• No existe error alguno en la distribución de la intensidad.

Comprender estos supuestos resulta especialmente importante, dado que la técnica DLS en sí misma produce distribuciones con amplitud de pico inherente, por lo que siempre habrá algún error en la representación de la distribución de intensidad. Como tal, las distribuciones de volumen y número derivadas de esta distribución de intensidad se utilizan principalmente con fines comparativos, o para estimar las proporciones relativas donde existen múltiples modos, o picos, y nunca deben considerarse absolutas. Por lo tanto, se considera una buena práctica informar el tamaño del pico en base a un análisis de intensidad e informar los porcentajes relativos únicamente (no el tamaño) a partir de un análisis de distribución de volumen.

Correlación adaptativa

Los instrumentos de DLS controlan la cantidad de luz dispersa mediante partículas difusivas. La intensidad de la luz dispersa está fuertemente influenciada por el tamaño de las partículas. Para dispersores isotrópicos, por ejemplo, la intensidad es proporcional a la sexta potencia del diámetro de partícula. En el rango del Zetasizer Nano, se decarta el 50% de las subcorridas con las tasas de conteo más elevadas, a fin de reducir el impacto de los datos erráticos causados por los contaminantes de la muestra (partículas más grandes = tasas de conteo más elevadas). El nuevo Zetasizer Range emplea otro abordaje estadístico, en el que cada subcorrida se estudia individualmente, y dependiendo de cuánto difieren estadísticamente de las otras subcorridas, se pueden clasificar como datos de estado estacionario o transitorios.

Datos de estado estacionario

Los datos de estado estacionario describen las partículas que constantemente son parte del volumen de medición y, por lo tanto, son característicos de toda la muestra que se analiza. El índice de polidispersidad (PDI) de cada subcorrida es el parámetro clave de esta clasificación de datos. El fundamento detrás de este abordaje es que el PDI es especialmente susceptible a la presencia de poblaciones más extensas, pero también a otros efectos (ruido) en la función de correlación. Con la ayuda de modelos estadísticos, es posible determinar la relevacia estadística del PDI y clasificar las subcorridas como representativas de la muestra o simplemente como eventos transitorios.

Datos transitorios

En contraposición, los datos transitorios son generalmente partículas no representativas del volumen de detección o del grueso de la muestra (es decir, agregados, polvo y otros contaminantes). El impacto (o frecuencia) de los datos denominados eventos transitorios puede verificarse en el parámetro “Correr retención”, que muestra el porcentaje de corridas que se han ejecutado para el análisis de estado estacionario, y así el porcentaje de corridas que fueron excluidas. Es importante destacar que los datos transitorios nunca se eliminan del análisis, lo que puede mostrarse por sí mismo, o de qué modo hubiera afectado la muestra original exhibiendo los resultados no filtrados. De este modo, el analista puede controlar cómo la correlación adaptativa mejora los resultados.

Otra ventaja de la correlación adaptativa es la capacidad de reducir aún más el tiempo de análisis. Se sabe que las corridas de menor duración generan resultados más confiables, limitando el impacto total de los eventos transitorios en el análisis. Otra nota de aplicación [Correlación adaptativa: nuevo abordaje para producir los datos DLS más confiables en menos tiempo] ha explicado que 10 subcorridas de un segundo cada una producen resultados más repetibles que una subcorrida de diez segundos de duración. En el nuevo Zetasizer, el número de subcorridas y su longitud se determinan hasta el punto en que añadir más datos no mejora significativamente la confianza del resulatdo, por lo que ofrece un resultado final de mejorada reproducibilidad.

MADLS

Las partículas más grandes que 1/10 del λlaser muestran dependencia angular en la intensidad de la luz dispersa. Más aún, este efecto adquiere gran importancia cuanto mayor sea el tamaño de la partícula, hasta el punto en que la dispersión de partículas se vuelve una compleja función de máxima y mínima dependiendo del ángulo de detección.

Con su considerable distorsión hacia ángulos de detección frontales, se ha recomendado que al momento de buscar la presencia de agregados, se debe utilizar el detector de 13°. El software del Zetasizer Nano posee la funcionalidad de medición de ángulo dual, que permite realizar dos mediciones individuales a ángulos de retrodispersión y dispersión frontal, lo que brinda un panorama más completo de la situación. De todos modos, los analistas obtendrían dos resultados distintos en lugar de un único gráfico representativo de toda la muestra. El nuevo Zetasizer Ultra posee tres detectores, en lugar de dos, que se encuentran posicionados a distintos ángulos (posterior, lateral y frontal), que se pueden utilizar para alcanzar un único resultado de mayor resolución -dispersión de luz dinámica multiangular (MADLS^®).

Como técnica, DLS posee sus limitaciones para resolver poblaciones de distinto tamaño dentro de la misma muestra. MADLS utiliza la dependencia angular de la luz dispersa para mejorar la resolución de la técnica, combinando la información obtenida a distintos ángulos y otorgando una única distribución de tamaño de mayor resolución. Es importante destacar que el rango de concentraciones que puede emplearse en este tipo de medición es más limitado en comparación con el rango del análisis de retrodispersión (NIBS®), dado que también pueden detectarse algunos efectos generalmente presentes en las mediciones de dispersión frontal y lateral (por ejemplo, dispersión múltiple, fluctuaciones de números, entre otros). Los resultados de MADLS se muestran principalmente como distribuciones de tamaño de partículas ponderadas por volumen, pero también se pueden convertir a intensidad (ponderada por retrodispersión) y a distribuciones de tamaño de partícula según el número, ofreciéndo así más información.

Concentración de partícula

Al medir el tamaño de partícula y la intensidad dependiente del ángulo de la luz dispersa, de donde se sustrae la intensidad dispersa del buffer (fondo), el Zetasizer Ultra puede otorgar información sobre el número de partículas por ml de solución.  Más aún, si la muestra contiene distintas poblaciones, puede producir una concentración de partículas confiable por cada población presente, dado que utiliza los mismos principios de una medición MADLS (determinación de tamaño de mayor resolución). Los resultados de la concentración de partículas se pueden expresar en gráficos de concentración acumulada de partículas o concentración distribuida de partículas o como valor total de concentración de partículas. Al igual que en la medición MADLS, el rango de concentraciones que puede utilizarse es más limitado que si se realiza una medición NIBS®.

Aunque la concentración de partículas aparece como una medición independiente en el software ZS XPLORER, se trata de una extensión de una medición DLS multiangular, por lo que también se obtiene un resultado MADLS.

Figura 1: Ejemplo de datos de autocorrelación de 1 µm y 3 µm de látex en agua.
Se muestran mediciones de tubo capilar de 1 mm y de cubeta de 10 mm. Si bien estas muestras son monodispersas, los resultados de las partículas en la cubeta de 10 mm muestran otro modo de descomposición en la función de autocorrelación medida.

Desafiando los límites de DLS: Medición de partículas grandes con el nuevo Zetasizer Ultra en celda de dimensionado de bajo volumen

La dispersión de luz dinámica (DLS) permite la medición del tamaño hidrodinámico de partículas en dispersión, cuantificando el movimiento por difusión. En el caso del tamaño de partículas cercano al rango máximo para DLS, la sedimentación, las corrientes térmicas y las fluctuaciones de número pueden afectar la dispersión detectada y, por ende, la exactitud del movimiento puramente difusivo, por lo que el análisis del tamaño de partícula se vuelve menos exacto.

Esto se puede observar en la Figura 1, en las mediciones de muestras monodispersas que exhiben artefactos en la línea inicial de la función de correlación. Esto se puede mitigar ajustando el dispersante, ya sea en cuanto a densidad o viscosidad. Sin embargo, ninguno puede ofrecer la solución óptima, dado que ya no se mide el sistema original de interés.

Esta nota de aplicación analiza la forma en que la celda de dimensionado desechable de bajo volumen puede mejorar la calidad de los datos en partículas de gran tamaño y permitir la exploración del rango de tamaño completo de DLS sin modificar el sistema de dispersante.

Sedimentación

A medida que aumenta el tamaño de partícula, el movimiento browniano térmico ya no es suficiente para mantener las partículas suspendidas, y es probable que las muestras sedimenten con el tiempo, lo que significa que el movimiento de las partículas dejará de ser aleatorio.

Sin embargo, podemos evitar la sedimentación como factor dominante para la distorsión del tamaño de partículas a mayores tamaños, si consideramos el tiempo que tardan las partículas para atravesar el haz de láser incidente durante la medición DLS. A continuación, la Figura 2 muestra que las escalas de tiempo asociadas con la sedimentación son mucho mayores a los tiempos de correlación utilizados para capturar datos en una típica medición de DLS, incluso considerando diferencias en la densidad de material.

Figura 2: Tiempo de sedimentación calculado como función del tamaño de partícula para partículas de látex de poliestireno (ρ = 1050 kg/m3) y de sílice (ρ = 2650 kg/m3) dispersas en agua a 25°C (η = 89 x 10-3 Pa s).

Efectos térmicos

La medición de partículas mayores a 1 micrón puede mostrar diferencias en la variabilidad como función de temperatura, lo que sugiere que los efectos térmicos pueden influir en los artefactos que se observan en la función de correlación medida. El modelado térmico de una cubeta de 10 mm, con control de temperatura mediante el contacto con el soporte de celda del instrumento, muestra que la geometría de la cubeta admite la formación de corrientes de convección, Figura 3. Sin embargo, el modelado de un tubo capilar, con un control de temperatura similar, no admite corrientes de convección, debido a las limitaciones impuestas por las estrechas secciones transversales.

Este modelado no analiza el impacto del tamaño de partícula en la importancia de los efectos de convección. Sin embargo, si consideramos la velocidad de difusión como función del tamaño de partícula, las partículas más pequeñas se dispersan más rápido y, por ende, el movimiento difusivo de las mismas será la principal propiedad de transporte. Con partículas más grandes, la difusión es más lenta y la mayor sección transversal de las partículas indica que recibirán la influencia de las corrientes adicionales.

Figura 3: Modelos térmicos de una cubeta de 10 mm y un tubo capilar de 1 mm, calculados con ANSYS. Los gradientes de velocidad impulsados por calor representan la condición de estado estacionario después de 120s de equilibrio con un dispositivo Peltier en la parte inferior de cada imagen que controla el sistema. El retículo rojo indica la posición del volumen de detección en donde se realizan las mediciones de DLS.

Resultados y consideraciones

A fin de demostrar la mayor exactitud de la medición de partículas de mayor tamaño facilitada por el tubo capilar, se preparó una serie de partículas de látex de poliestireno de diferentes tamaños en una solución de 10 mM de NaCl, y se las midió tanto en la celda de dimensionado desechable de bajo volumen como en la cubeta estándar de 10 mm. La Figura 4 muestra la media y la desviación estándar del tamaño de partícula, que indica que, sin modificación del dispersante, las mediciones realizadas en cubeta estuvieron fuera del rango especificado en alrededor de 1 µm, mientras que las realizadas en el tubo capilar resultaron confiables y exactas hasta 10 µm.

Figura 4: Discrepancia en el tamaño de partícula medido, derivado del análisis de cumulantes y error asociado, comparado con el tamaño nominal especificado de un rango de partículas de látex de poliestireno rastreables según NIST, medido en cubeta de 10 mm y tubo capilar de 1 mm.

A fin de demostrar mediciones optimizadas en un rango de tamaño más amplio con una muestra polidispersa, se tomó una muestra arbitraria de suelo del Reino Unido y se la dispersó en agua filtrada ultra pura; luego se midió en una cubeta de 10 mm y en una celda de dimensionado desechable de bajo volumen. La caracterización del suelo resulta esencial para comprender la incursión de las nano y micro partículas en el medio ambiente. Sin embargo, las barras de error para las mediciones en cubeta de la Figura 5 sugieren que DLS no constituye la técnica más apta para este caso. De todos modos, las mismas mediciones realizadas con la muestra cargada en el tubo capilar brindan mayor resolución y repetibilidad optimizada, como lo ilustran las barras más estrechas, aunque la muestra sea polidispersa en tamaño de 100 nm a más de 1 μm aproximadamente.

Figura 5: Distribución del tamaño de partícula ponderada por intensidad para una muestra polidispersa de suelo, medida en cubeta de 10 mm (izquierda) y en tubo capilar de 1 mm. La distribución representa un promedio de 10 mediciones y sus desviaciones estándar correspondientes. Las mediciones del tubo capilar muestran una mejor repetibilidad, observada en las barras de error más estrechas, y mayor resolución.

Conclusión

Se ha demostrado que, en el rango superior del tamaño mensurable de la dispersión de luz dinámica, las corrientes térmicas constituyen el fenómeno dominante que genera artefactos en la función de correlación, deteriorando así la exactitud de la medición. La geometría del tubo capilar de 1 mm empleada en la celda de dimensionado desechable de bajo volumen no admite la formación de las corrientes de convección y, por lo tanto, permite mediciones exactas sin la modificación del dispersante de la muestra en todo el rango del tamaño mensurable para DLS. Además, alcanza una mejorada repetibilidad para las muestras polidispersas en relación con mediciones comparables en una cubeta estándar.

Más información:
www.cas-instrumental.com.ar