De acuerdo a las nuevas y estrictas regulaciones que se aplicarán a la industria farmacéutica, la demanda para el análisis de metales pesados alcanzará niveles sin precedentes. Las Técnicas como Absorción Atómica e ICP que han sido el estándar para la determinación de metales en esta rama de la industria, será gradualmente reemplazada por ICP-MS (con muy superior nivel de sensibilidad) y en ese contexto las técnicas de preparación de muestras han cobrado una importancia crucial para estos análisis.

El enfoque tradicional para la digestión de muestras asistida por microondas, consistente en un horno con diseño especifico para aplicaciones de laboratorio con un rotor con vasos cerrados en su interior, ha probado su valía proporcionando digestiones completas en forma rápida, con alta recuperación de componentes volátiles, en un entorno de trabajo limpio y seguro. Una de las pocas limitaciones de esta técnica viene dada por cierta dificultad en la digestión simultánea de compuestos con diferentes matrices y en la cantidad de muestra que se puede procesar en cada recipiente.

El sistema de digestión por microondas de una única cámara de reacción (SRC: Single Reaction Chamber), es un nuevo y revolucionario concepto desarrollado por Milestone que incorpora todos los beneficios del vaso cerrado, con nuevos niveles de utilidad y efectividad.

El UltraWAVE de Milestone es un instrumento de mesada que opera a muy alta presión y temperatura, capaz de procesar simultáneamente muestras difíciles, diferentes y en cantidades hasta ahora imposibles, en forma rápida y sencilla. Los datos que se muestran en esta nota técnica, demuestran que las digestiones de muestras en el UltraWave resultan en datos analíticos de calidad uniforme y alta, siendo una herramienta de alta utilidad para enfrentar los desafíos que imponen las nuevas normas de detección de trazas en la industria Farmacéutica.

El sistema SRC fue usado con muestras de la industria Farmacéutica para la digestión previa al análisis por ICP-MS durante el desarrollo de los borradores de los capítulos 232 y 233 de la USP.

Imagen 1: UltraWave

Una vez optimizados los métodos (tipo de viales, reactivos de digestión y programa de temperatura) se realizó la digestión de suplementos dietarios, para el análisis de los cuatro elementos tóxicos más relevantes (“the big four”: As, Cd, Pb y Hg). Los datos obtenidos para las muestras de control demuestran que la metodología SRC es adecuada para el tratamiento de este tipo de muestras.

La implementación de los capítulos 232 y 233 de la USP para el análisis de contaminantes inorgánicos en muestras farmacéuticas, ya varias veces postergada, se aproxima. Si bien algunas muestras solubles en soluciones acuosas o en solventes orgánicos pueden ser analizadas en forma directa, una gran proporción de las muestras requerirán la digestión previa al análisis por ICP-MS; de hecho, la digestión también es recomendada para las muestras solubles en solventes orgánicos. La USP estipula la digestión en recipientes cerrados y es esperable que la digestión por microondas sea la técnica predominante, dado que las altas presiones y temperaturas alcanzables ofrecen un mayor poder de digestión frente a otras técnicas cono la digestión en vaso cerrado sobre planchas calefactoras.

El sistema de digestión SRC es un tipo relativamente nuevo de digestión en recipiente cerrado que difiere significativamente de la digestión en vaso cerrado tradicional. El sistema de digestión SRC de mesada, puede procesar hasta 15 muestras en forma simultánea a alta presión y temperatura, permitiendo la digestión completa de, virtualmente, cualquier tipo de fórmula farmacéutica, con contenidos muy bajos de Carbono Orgánico Total en la solución, lo que resulta altamente beneficioso para el posterior análisis por ICP-MS.

Dos tipos de muestras, mosto de St. John y aceite de pescado, ambas muy utilizadas en productos farmacéuticos, fueron digeridas con el sistema SRC y luego analizadas pro ICP-MS con celda de impacto para determinar los 4 elementos tóxicos indicados en la USP a fin de evaluar la eficiencia de la digestión con SRC para esta aplicación. Dado que las muestras se digieren en forma simultánea en el recipiente del SRC, se incluyeron duplicados y fortificaciones para confirmar la retención de elementos volátiles y la ausencia de contaminación cruzada.

Figura 1

Instrumentación:
El sistema de digestión SRC posee un gran vaso o cámara de reacción presurizado (típicamente de 1 lt.) que es a su vez la cavidad de microondas, permitiendo optimizar la intensidad y distribución de la energía de microondas entregada de acuerdo a la forma de la cavidad, por lo que no es necesaria la rotación de las muestras para asegurar la distribución homogénea de la energía. Las muestras se colocan en recipientes o viales individuales dentro de la cámara de reacción y son digeridas en forma simultánea. Dado que lo que se presuriza es la cámara, no se requieren recipientes o vasos de presión individuales para cada muestra. Las muestras son pesadas en viales o tubos de pequeñas dimensiones, y una vez agregado el ácido para la digestión los viales se posicionan en un rack o soporte. Los viales son tapados con tapas comunes, sin ajuste, al solo efecto de prevenir la contaminación por la caída de una gota que eventualmente pudiera condensar sobre el techo o tapa de la cámara (las tapas no deben tener ajuste para permitir que se iguale la presión dentro y fuera del vial). El rack con los viales se coloca dentro de la cámara, la cual una vez sellada es presurizada con Nitrógeno a una presión de 40 bar en forma previa a la emisión de microondas.

Esta pre-presurización evita que las soluciones hiervan o eyecten, evitando la pérdida de elementos volátiles y la contaminación cruzada. Dado que la presión de la cámara aumenta en la medida que aumenta la temperatura de las muestras, nunca se alcanza la ebullición.

El SRC puede operar a muy alta temperatura y presión (hasta 300ºC y 199 bar) lo que permite la digestión de virtualmente cualquier muestra farmacéutica, incluyendo aceites y cápsulas de gel enteras. Las muestras con alto contenido de materia orgánica como los aceites producen presión adicional en la cámara debido a la generación de NOX y CO2: en los sistemas de digestión por microondas tradicionales se deben usar recipientes de presión (típicamente 100 bar) para cada muestra. La capacidad del SRC para trabajar a mayores presiones permite digerir mayor masa de muestra, incluyendo cápsulas de gel enteras que no pueden ser digeridas en recipientes de presión individuales de los sistemas tradicionales. En el sistema SRC dado que todas las muestras son digeridas en forma conjunta en las mismas condiciones, se pueden procesar distintos tipos de muestra en un mismo lote, sin necesidad de programar lotes o secuencias diferentes para cada tipo de muestra. Materias primas, excipientes y productos finales pueden ser digeridos en un único lote con el mismo programa.

Las metodologías con SRC requieren además menor cantidad de ácidos (típicamente 2 a 4 ml) lo que resulta en una reducción en los niveles de los blancos de reactivo. Una vez completado el programa, la cámara es venteada y se remueve el rack. Las muestras pueden ser llevadas a volumen en el mismo vial y quedan listas para ser analizadas. El sistema SRC utilizado en este trabajo fue un sistema de mesada UltraWave de Milestone.

OPTIMIZACION DEL METODO
Los viales de muestra típicamente utilizados en el sistema SRC pueden ser de cuarzo, TFM (polímero de alta temperatura) o vidrio borosilicato. La ventaja del vidrio es su muy bajo costo, lo que permite descartar el vial luego de su uso, eliminando el proceso de limpieza. El vidrio puede producir altos niveles de fondo (a niveles de ppb) de algunos elementos, específicamente B, Na, Mg, Al, K y Ca. No obstante, dado que estos elementos no están estipulados en la USP 232, los viales de vidrio pueden ser usados. La fig. 2 muestra los niveles de los elementos de la USP en los blancos realizados en viales de vidrio, cuarzo y TFM. En este grupo de datos no fueron medidos el Ru, Os y los elementos del grupo del Pt. No obstante, se puede asumir que la contribución de los viales para estos elementos es extremadamente baja.

Figura 2 y 3

El programa usado puede aplicarse a todo tipo de muestra: pre-presurización con N a 40 bar, rampa a 240ºC en 20 min., sosteniendo luego esa temperatura por otros 20 min, totalizando 40 minutos. El tiempo de enfriamiento es de aproximadamente 15 min. con lo que el tiempo total es de 55 min. Si todas las muestras del lote fuesen fáciles de digerir, la temperatura de digestión podría reducirse a 200 ºC con la consiguiente reducción en el tiempo de enfriamiento. La Fig. 3 muestra la gráfica obtenida luego de un programa de digestión en el SRC. La línea roja muestra la superposición de la rampa de temperatura con la temperatura real alcanzada durante el programa. La línea amarilla muestra la potencia de microonda aplicada, la cual es ajustada automáticamente por el software de forma tal que la temperatura real siga exactamente el perfil de temperatura programado. El controlador PID (Proporcional, Integrativo, Diferencial) ajusta automáticamente la potencia independientemente de la cantidad demuestras, volumen de ácido y masa de cada muestra. La línea azul muestra la evolución de la presión durante el proceso. Nótese que se alcanzan presiones superiores a los 100 Bar, que no son posibles en los vasos cerrados de los sistemas tradicionales. Esta mayor presión posibilita la digestión de mayores masas de muestras con alto contenido de materia orgánica.

Además, la mayor presión permite alcanzar mayores temperaturas lo que resulta en digestiones más completas. Aún en muestras con alto contenido orgánico como aceites, virtualmente todo el carbono orgánico es descompuesto en CO2 resultando digestos con muy bajos niveles de Carbono Orgánico Total. Este bajo contenido es beneficioso en el análisis por ICP-MS, resultando en el análisis más predecible y confiable de los elementos pobremente ionizados.

La matriz de digestión depende del tipo y peso de la muestra. Las cápsulas de producto terminado (mosto de St. John) fueron molidas y se digirieron 0,5 gr de muestra con 4 ml. de HNO3 + 1 ml. de HCl. En le caso de las cápsulas de gel de aceite de pescado, se digirió una cápsula entera (1 gr.) con 10 ml. de HNO3 + 1 ml. de HCl. Se utilizaron viales de 12 ml. permitiendo la digestión conjunta de 15 muestras. Dado que todas las muestras son digeridas en forma conjunta bajo el mismo control de temperatura y presión, se pueden digerir diferentes masas de muestras con distintos ácidos en forma simultánea. El único requerimiento es que la temperatura de digestión programada debe ser suficiente para digerir la muestra más difícil del lote.

Tabla 1

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